超高压升/卸压过程对杀菌效果的影响研究进展

张 凡 王永涛 廖小军

（中国农业大学食品科学与工程学院 北京100083）

食源性病原微生物引起的食源性疾病是全球食品安全的核心问题。根据国家卫生计生委统计，2011—2015年我国食物中毒类突发公共卫生事件共报告844 起，累计中毒人数32 151 人，死亡623 人，其中由微生物引起的食源性疾病暴发事件数、患者数和死亡人数分别占36.5%，60%和6.4%[1]。由此可见，微生物引起的食品安全问题不容忽视，如何在食品加工过程中最大程度地杀灭病原性微生物，从而保障食品的安全成为食品加工业研究的重点[2]。

传统的食品热杀菌技术虽然可以有效杀死微生物，但是加工过程中较高的温度会导致食品发生一系列的物理和化学变化，使食品的质构、颜色、风味和营养等品质发生劣变，从而降低食品原有的感官及营养价值，限制了热杀菌技术的进一步应用[3-4]。非热杀菌技术可以避免高温处理带来的食品品质劣变问题，近年来成为新的研究热点[5]。超高压（High hydrostatic pressure，HHP）是非热杀菌技术中商业化应用较为成功的一种杀菌技术，它是指用柔性材料将食品进行包装后，以水或者其它液体介质为媒介传递压力，使食品在常温或者较低温度下经100～1 000 MPa 的高压处理一段时间，从而达到灭菌、钝酶、改善食品品质以及延长食品货架期的新型杀菌技术[6-7]。而对于大部分食品来说，300～600 MPa 的超高压处理即可灭活霉菌、酵母菌以及绝大多数食源性病原菌[8]。

在商业化的食品超高压加工中，由于获得良好的杀菌效果是该技术产业应用的必要条件，因此很多研究集中在超高压杀菌条件的优化。影响超高压杀菌效果的因素有很多，如处理温度、压力、保压时间等。不断有研究表明，超高压升/卸压过程也能显著影响微生物的杀灭效果。本文重点讨论了不同超高压升/卸压过程对杀菌效果的影响，旨在推进我国在超高压杀菌技术上的研究和应用，进而保障超高压食品的安全。

1 影响超高压杀菌效果的因素

目前普遍认为，影响超高压杀菌效果的因素主要有：处理温度、压力、保压时间、微生物的种类和生长状态以及微生物生长环境（样品性质）等[9-10]。

1.1 处理温度

环境温度是微生物生长代谢的重要外部条件之一，温度条件的设置显著影响超高压杀菌的效果。有学者发现，室温（15～30 ℃）条件下微生物对压力具有最大抗性，对食物进行高压处理并结合温度的控制（高于或低于室温）能够提高其表面或内部微生物的高压敏感性，从而可以在较低压力下迅速完成杀菌过程[11-12]。通常300～400 MPa 下，微生物的膜结构（如线粒体外膜、核膜及细胞膜）遭到破坏，通透性变化，同时低温或高温会影响微生物细胞内生物大分子间的疏水作用、范德华力和氢键等作用，微生物细胞内正常代谢活动被破坏。通过超高压技术予以适当温度控制，将有助于提高其杀菌效果[13]。

Capellas 等[14]在20 ℃下对牛肉中的大肠杆菌进行400 MPa/15 min 处理，此时菌落总数降低仅约1 个对数，而在50 ℃下进行400 MPa/15 min 处理，菌落总数可降低6 个对数，杀菌效果显著增加。Meng J 等[15]研 究 发 现300 MPa/15 min/60 ℃处理磷酸缓冲液体系中的枯草芽孢杆菌，可使其菌落数下降6 个对数，而在300 MPa/15 min/40 ℃下，枯草杆菌只降低2.7 个对数。

此外，当处理温度较低（如10 ℃）时，普通商业化超高压 400～600 MPa 杀菌条件很难杀灭食品中抗性极强的芽孢。将超高压与较高温度（如80 ℃）协同作用于芽孢则可以取得较好灭菌效果[16]。

1.2 压力和保压时间

在一定范围内，超高压灭菌效果与压力和保压时间成正比。纵伟等[17]研究了不同压力对苹果酱中菌落总数的影响，结果表明：低于200 MPa 时超高压杀菌效果不理想；400 MPa 高压处理后果酱中菌落总数显著降至30 CFU/mL；而经600 MPa 处理后，果酱中的微生物完全被杀灭。张隐等[18]对泡椒凤爪中的微生物进行超高压灭菌处理，研究表明300 MPa/5 min 处理后泡椒凤爪中菌落总数为5.6×103CFU/mL，400 MPa/5 min 处理后菌落总数降至23 CFU/mL，符合国家GB 2726-2005《熟肉制品卫生标准》中菌落总数的要求。Calik H等[19]研究发现在500 MPa/30 s 下牡蛎中的副溶血性弧菌从109CFU/mL 降至10 CFU/mL，而在350 MPa 下只有持续加压14.5 min 才能达到相同的杀菌效果。

邓晶晶等[20]对珊瑚萝卜表面的微生物进行超高压处理，发现200 MPa/5 min 处理后菌落总数降低240 CFU/g，将处理时间增加到15 min 后菌落总数降低420 CFU/g，此时仍有微生物残留；而在350～500 MPa/5～15 min 下对其进行杀菌处理后菌落总数小于2 CFU/g，绝大多数微生物被杀死，说明杀菌效果与压力和保压时间呈正相关，且此时压力大小更能影响超高压对珊瑚萝卜灭菌效果。然而，Yuste J 等[21]认为在一定程度上延长处理时间比提高处理压力更能显著杀灭缓冲液中的金黄色葡萄球菌。

1.3 微生物种类及其生长状态

不同种微生物之间耐压性差异较大，同一种属微生物的不同菌株之间也有一定差异。通常情况下，微生物结构越复杂，对压力越为敏感，原核生物通常比真核生物有更强的耐压能力[22]。细菌营养体的耐压性与细菌种类有关，革兰氏阴性菌（G-）耐压性较差，200～400 MPa 的压力即可将其杀灭，而革兰氏阳性菌（G+）细胞壁含有丰富的肽聚糖，相对较厚，结构机械性强，耐压性较高，需要400 MPa 以上的压力才能将其杀灭[23]。然而，也存在特例，如明串珠菌（革兰氏阳性菌）比大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌（革兰氏阴性菌）更不耐压[24]。细菌芽孢具有较厚的芽孢衣和皮层等特殊结构，使其在常温下具有极强的抗压能力，能够耐受1 200 MPa 以上的超高压处理，通常需要结合一定温度的热协同作用才能更好地杀灭芽孢类微生物[25]。

细菌整个生长周期包括调整期、对数期、稳定期及衰亡期，总体而言处于稳定期的细菌具有更强的耐压性[26]。有报道称在高压条件下，处于稳定期的大肠杆菌和单核细胞增多性李斯特菌可分别合成RpoS 和SigB 蛋白，这属于细菌的应激反应，有助于其抵抗不良环境，从而使表现出一定的耐压性[27]。

1.4 微生物存在环境

微生物的生存环境也会影响超高压的杀菌效果。首先，每种微生物都有其最适生长pH 范围，不同pH 条件下微生物的耐压性不同，有研究认为在酸性环境下对微生物进行超高压处理可获得更好的灭活效果[28]。其次，微生物的培养基质也会影响超高压杀菌效果。比起非营养型基质，营养型基质中的微生物更耐压[29]。这主要是由于营养基质中多含蛋白质、碳水化合物以及脂类等物质，在压力传递过程中这些物质可对微生物起到缓冲保护作用，提高其抗压性。基质中存在的盐离子也会对微生物起到保护作用。例如Patterson[30]发现，比起甘油或蔗糖溶液，NaCl 或CaCl2溶液中的凝结芽孢杆菌耐压性增强。此外，环境中水分活度降低可以增强微生物的抗性，而向体系中加入细菌素、溶菌酶、壳聚糖、天然香精油等抗菌剂，则能与超高压杀菌产生协同作用，提高杀菌效果。周頔[31]发现超高压协同溶菌酶、壳聚糖处理对卤牛肉有显著的抑菌作用，且此时超高处理后牛肉色泽鲜亮，硬度适中，咀嚼性较好。

2 超高压升/卸压过程对杀菌效果的影响

除上述影响超高压杀菌效果的因素外，有研究发现，超高压升压过程及卸压过程也会对杀菌效果产生影响，而这一影响因素的研究在现有文献中主要集中在升/卸压速率的影响以及升压方式的影响两方面。由于相关研究文献较少，本文仅对已有的研究结论进行总结、分析和比较。

2.1 升/卸压速率对杀菌效果的影响

2.1.1 对细菌营养体杀灭的影响

1）升/卸压速率共同影响杀菌效果 在初期，研究者发现同时改变处理过程中的升压和卸压速率，可以得到不同的杀菌效果。Herdegen[32]发现相比0.83 MPa/s 的升压速率和6.7 MPa/s 的卸压速率，6.7 MPa/s 的升压速率和0.83 MPa/s 的卸压速率更有利于杀灭无害李斯特菌。不同于以上试验结果，Rademacher 等[33]发现，在室温条件下对接种在缓冲液中的无害李斯特菌采用不同的升/卸压速率处理后，快速升压/慢速卸压（8.3 MPa/s，1.7 MPa/s）与慢速升压/快速卸压（1.7 MPa/s，8.3 MPa/s）相比，在加压过程中温度变化不予考虑的情况下，两者杀菌动力学并无显著差异，即升/卸压速率不影响杀菌效果。此外，Ferriera 等[34]在HHP（300～400 MPa/1～5 min）处理下，对比3 种升/卸压速率，发现在300 MPa/5 min 下慢速升压（1.5 MPa/s）结合慢速卸压（3.2 MPa/s）可以显著提高无害李斯特菌的杀灭效果。

以上研究结果均表明，超高压处理过程中的升/卸压速率可以共同影响杀菌效果，而升压或卸压速率对杀菌效果的单一影响则还需进一步明确。

2）升压速率单一影响（固定卸压速率）杀菌效果 在明确了升/卸压速率能够共同影响杀菌效果之后，研究者在固定卸压速率的条件下，继续对升压速率单一的作用进行研究。其中，Syed 等[35]研究表明，无论是接种在橘子汁、脱脂牛奶还是缓冲溶液中的大肠杆菌，在卸压速率一定的情况下，比起1.3 MPa/s 的慢速升压过程，11.4 MPa/s 的快速升压过程能产生更好的杀灭效果。随后，Syed等[36]分别以33，10，5 MPa/s 的快、中、慢升压速率对3 种基质中的金黄色酿脓葡萄球菌进行灭菌处理，得到相同的试验结论，即快速升压更有利于杀灭微生物。王永涛[37]在相同卸压条件下（＜3 s），研究HHP（400～600 MPa/2.5～25 min）不同升压速率（2 MPa/s 和1 MPa/s）对紫甘薯汁中天然菌群的杀灭效果，结果表明更快的升压速率能够显著提高紫甘薯汁中自然菌群的杀灭效果。王永涛[37]以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对象进行研究，发现相比于慢速升压（1 MPa/s），快速升压（2 MPa/s）能够提高微生物细胞形态结构的破坏程度以及膜的通透性。如图1所示，王永涛[37]发现快速升压下大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的细胞膜破裂，细胞质流失，原生质团聚，大面积空白细胞数量和程度增加。Chapleau 等[38]也表示快速升压过程中，微生物受到更为显著的压力刺激，细胞破坏程度更大，杀菌效果更明显。此外，Jppm[39]还提出慢速升压方式可能会引起细菌细胞内的应激反应，使其耐压性提高，从而降低超高压杀菌的效果，也就是说快速升压过程可能更有利于杀灭微生物。

3）卸压速率单一影响（固定升压速率）杀菌效果 在明确了快速升压下细菌营养体受损更严重后，研究者在固定升压速率的条件下，继续对卸压速率单一的作用进行研究。其中，Noma 等[40]通过快速（1 ms）、慢速（＞30 s）卸压过程对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓假单胞菌、副溶血性弧菌的菌悬液进行HHP（70～400 MPa/0～60 min/-20～25℃）杀菌效果分析，发现前者D 值（杀灭90%微生物所需时间）显著小于后者（P＜0.05），即快速卸压可使灭菌效果更加显著。此外，Noma 等[41]以接种在苹果汁、橘子汁以及缓冲液中的大肠杆菌为目标菌，研究HHP（150 MPa/20 min）快速（2 ms）、慢速（＞30 s）卸压过程后的杀灭效果。试验结果表明，对于接种在果汁以及缓冲液中的大肠杆菌，快速卸压均比慢速卸压更能杀死目标菌。同时，Noma等[40]指出，在相同的升压速率条件下，快速卸压过程往往伴随着由水产生的膨胀冲力，对微生物造成更大的损伤。也有学者认为，超高压升压伴随着传压介质水的压缩，且压缩程度与目标压强大小成正比。当系统突然快速卸压时，水产生较大的绝热膨胀冲力，此时细菌细胞壁受到更严重的影响，一些细胞发生空穴现象，即细胞内容物丢失，从而获得更好的灭菌效果。

图1 不同速率超高压处理前、后大肠杆菌（a，250 MPa/5 min）和金黄色葡萄球菌（b，450 MPa/5 min）的TEM 图（40 000×）Fig.1 TEM images of E.coli and S.aureus treated by HHP（40 000×）

与Noma 等[40-41]结 论 不 同，Syed 等[36]研 究 发现，更长时间的慢速卸压过程杀菌效果更好。Syed 等[36]通过对接种在脱脂牛奶、橙汁、缓冲液体系的金黄色葡萄球菌进行快、慢速卸压的HHP（700 MPa/5 min）处理，得出慢速卸压（5 MPa/s）相比于快速卸压（70 MPa/s）更能有效杀灭金黄色葡萄球菌。同时，Syed 等[35]还比较了HHP（600 MPa/3 min）快、中、慢速卸压（12.9，6.9，2.6 MPa/s）对脱脂牛奶、橙汁、缓冲液体系中大肠杆菌的影响，研究发现慢速卸压下3 种体系中的大肠杆菌灭活效果好，即慢速卸压更有利于杀菌。

由于仪器、设备以及试验条件的不可比性，针对快、慢速卸压对杀菌效果的影响不同研究人员得到不同的试验结论。分析原因可能是：Noma等[40-41]的极快速卸压（1～2 ms）条件下水可以产生膨胀冲力，对微生物造成损害，因而灭菌效果好；而Syed 等[35-36]在目标压力为600～700 MPa 时设置的卸压速率分别为5，70 MPa/s，此时卸压时间远大于毫秒级，水产生的膨胀冲力不再是影响灭菌效果的主要因素。相反，较高压力条件下的慢速卸压保证了长时间高压对微生物的破坏作用，可以达到更好的灭菌效果。

2.1.2 对芽孢杀灭的影响 与细菌营养体不同，由于芽孢具有极强的抗逆性，对超高压处理有着较强的耐受性，通常需要热协同作用才能达到理想的灭菌效果[25，42]。正如超高压升/卸压过程会影响细菌营养体的杀灭效果，不同速率升/卸压对芽孢灭活效果也有影响，然而具体影响并无统一结论，仍需进一步研究。

Hayakawa 等[43]认为，卸压过程中产生的水膨胀冲力会破坏芽孢的保护层——芽孢衣，且冲力大小主要取决于卸压速率。快速卸压下处理压力越高，卸压过程中芽孢受到的膨胀冲力越大，受损更严重；即便提高处理压力，与快速卸压相比，慢速卸压过程无法产生较大的水膨胀冲力破坏芽孢结构，杀菌效果较差。同时试验结果也表明，200 MPa/60 min/75 ℃处理下，相比于慢速卸压（300 ms～2 400 s），快速卸压过程（1.30～1.65 ms）可杀灭4 个对数的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，杀菌效果显著[43]。

然而，Syed 等[44]在600 MPa/3 min/60～70 ℃的条件下研究了升/卸压速率对枯草杆菌芽孢灭活的影响，结果表明当温度控制在70 ℃时，慢速升压（3.6 MPa/s）比快速升压（15 MPa/s）可使更多的芽孢灭活；在60～70 ℃时，相比快速卸压（150 MPa/s），慢速卸压过程（5.7 MPa/s）可以取得更为显著的灭活效果。Syed 等[44]总结出在慢速升压和卸压条件下，芽孢灭活更充分。

不同于Hayakawa 等[43]认为的快速卸压（1.30～1.65 ms）下芽孢的结构被破坏，进而被杀灭，Syed等[44]研究中600 MPa 快/慢速卸压耗时4～105 s，该条件下无法实现前者卸压过程中产生的较大水膨胀冲力，即水膨胀冲力破坏芽孢结构不再是使芽孢灭活的主要因素。有研究表明，在超高压的作用下，芽孢内部DPA-Ca2+通道打开，DPA 被释放，芽孢皮层在皮质裂解酶的作用下发生裂解，随后芽孢萌发，萌发后的芽孢失去应对外界胁迫的抵抗力，在温度和超高压的作用下失活[45]。同时有研究表明较低（100～150 MPa）或中等（500～600 MPa）压力条件有利于芽孢的萌发[46-47]。Syed 等[44]试验中600 MPa 的目标压力伴随慢速升压过程有利于提高芽孢萌发的数量，慢速卸压过程则保证了已萌发芽孢受到更长时间的高压和热作用，因而Syed等[44]的试验结果为慢速升、卸压过程结合一定的超高压及温度作用，可以很好地使芽孢失活。

2.1.3 试验结果差异性分析 如上所述，不同研究结果均表明超高压升/卸压速率确实会影响杀菌效果，然而现有的试验结论不完全统一，不同升/卸压速率对细菌的杀灭效果影响见表1。导致试验结论不统一甚至完全相反的主要原因可以从下面几方面分析：

1）微生物种类的不同 不同种类微生物间的抗压性不同，会影响升/卸压速率对其杀灭效果的表现。例如，细菌营养体对不同升/卸压速率的处理表现出杀菌效果的差异，而芽孢抗压性要远远高于营养体，使这种不同升/卸压速率引起的差异在芽孢上不能表现出来。

2）微生物存在的基质不同（样品性质）现有文献中试验处理过程中微生物存在的基质不同，这会在较大程度上影响试验结果，这是由于微生物在天然食品、肉汤培养基、缓冲液、生理盐水等不同基质中的耐压性不同，因此经不同升/卸压速率处理后，取得的杀灭效果也不同。此外，若菌悬液介质的密度较大，则细菌细胞内水的流动性差，降压过程中水对细胞内表面产生的绝热膨胀冲击力被削弱，影响杀菌效果。同时，基质中pH值的大小也会影响细菌的耐压性，从而使试验结果产生差异。

表1 不同升/卸压速率对杀菌效果的影响Table1 Effect of different compression/ decompression rate on sterilization

（续表1）

3）试验条件的不可比性 超高压设备不同，其所允许设定的升压、卸压速率不同。严格上讲，快速、慢速升/卸压过程在不同文献研究之间没有可比性。例如Noma 等[40-41]在其试验中控制快速卸压1～2 ms，Hayakawa 等[43]控制快速卸压1.30～1.65 ms，比其余试验中的卸压速率快3 个数量级，加之不同试验中选择的温度、压力、保压时间、传压介质等不同，均会对最终的试验结果产生影响。Montserrat M 等[48]也指出，即使针对同种食物中的同一菌株，超高压设备性能不同，操作程序不同，也会产生不同的杀菌效果。

2.2 升压方式对杀菌效果的影响

超高压设备的增压方式分为两种：内部增压和外部增压。这两种增压方式的区别见表2。其中内部增压方式较多应用于实验室的研究，外部增压方式多用于实际生产中。外部增压器分为单向和双向增压器两种，且二者的增压曲线不同，如图2所示。单向增压器在一次增压过程中只能产生有限的压力，增压结束后需进行换向（此时将出现一个压力停滞期），而后再进行后续的增压过程，因而增压曲线中会出现多个平台，曲线表现为阶梯状样式。双向增压器类似于将两个水平运动相反的单向增压器联合使用，当一向增压器增压时，另一向增压器中的传压介质可得到补充，因而一次增压结束并换向后可以继续增压，中间没有压力停滞期，曲线表现为一条直线的样式。

表2 两种增压方式的差异Table2 The difference of two compression mode

图2 单向（a）和双向（b）增压器所产生的升压曲线示意图Fig.3 Pressure profile of one way（left）and two way（right）supercharger as a function of time

升压过程中升压方式的不同，也会对微生物的杀灭效果产生影响。王永涛[36]在升压和卸压速率一定的条件下，研究了升压过程中不同升压方式（直线式和阶梯式）对紫甘薯汁中自然菌群的影响，当目标压力为400～600 MPa、保压时间2.5～25 min、升压速率2 MPa/s 时，试验结果表明，直线式升压方式能够对自然菌群产生更好的杀灭效果，且这一效果在一定程度上随着目标压力及保压时间的增大而增大。

从不同升压方式对细菌造成的物理损伤看来，线性式升压下细胞受损更为严重，杀菌效果好。而对于阶梯状升压方式来说，增压过程中出现的若干个压力停滞期可能对微生物产生一定的保护作用，有利于其内部触发应激机制，提高微生物的耐压性；而在直线式升压过程中，微生物的细胞受到持续性损伤，因而直线升压方式更有利于杀灭微生物。细菌内具体哪种应激机制对超高压胁迫下自身的生存起到关键作用，还需进一步研究。卸压方式对杀菌效果的影响目前还未见相关报道。

3 结论与展望

超高压杀菌是一个非常复杂的过程，既与超高压设备、工艺流程、环境条件等有关，又涉及具体的食品体系、食品中天然微生物群落等。除此以外，超高压的升压和卸压过程中不同参数的设置也会对杀菌效果产生显著影响，在今后的超高压杀菌的研究或实际应用中需注意升/卸压参数的设定。

现有对升/卸压过程影响杀菌的研究主要集中在杀菌效果方面，相互之间的可比性较差。今后应在统一影响因素条件（微生物种类、培养基质、升/卸压的速率和方式）下对升/卸压过程影响杀菌进行系统性研究，使试验结果有参考意义。此外，升/卸压过程影响杀菌的机制还不完善。现有研究只关注了微生物的物理损伤，而不同升/卸压过程会使微生物产生不同的应激反应，从而引起杀菌效果的差异性。后续应开展从应激反应角度研究升/卸压过程影响杀菌的机制。

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2020年5月8日