肉制品中9种N-亚硝胺测定方法的建立

张建斌 马俪珍 张 甜 杨 华*

（1 天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津300384 2 天津农学院 食品科学与生物工程学院 天津300384 3 山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801）

N-亚硝胺是一类公认的毒性化合物，其化学通式为R1R2N-N=O，广泛存在于各类食品，尤其是肉制品中，一些挥发性N-亚硝胺可诱发细胞癌变[1-3]，是人类日常饮食安全的重要隐患[4]。食品中N-亚硝胺主要于食品加工和贮藏过程中形成，常见于腌制、焙烤及原料中等[5-7]。N-亚硝胺不但可以在外界环境中生成，还可以在人和动物的胃中形成[8]。检测N-亚硝胺的含量对于食品安全的监管和控制至关重要。

目前熟肉制品中N-亚硝胺物质的检测方法主要有气相色谱法[9]、液相色谱法[10]、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-热能分析法等[11-13]。N-亚硝胺在食品中含量较低，不易富集，前处理过程中稍有不慎就会对检测结果造成很大的影响；同时N-亚硝胺种类多，理化性质差异较大，同步检测的样品预处理方法不一定适用于多种N-亚硝胺。对传统腌制食品中N-亚硝胺的测定，国标方法中的前处理方法——水蒸气蒸馏法操作繁琐，耗时长，且试验过程中温度高，易使被测物质N-亚硝胺损失。目前提取和富集N-亚硝胺的方法采用较多的有低温真空蒸馏[14]、水蒸气蒸馏[15]、固相萃取[16]等。超声提取设备简单、操作容易、条件便于控制等优点[17]，可用于固相萃取。何淑娟等[18]、杨金川等[19]采用超声振荡提取法提取肉制品中的N-亚硝胺，通过固相萃取柱净化后，样品回收率在85%～98%和82.64%～98.24%。王秀元等[20]用超声振荡提取法提取腌制水产品中的N-亚硝胺后，采用活性炭柱净化，其对N-亚硝胺的回收率达到87%。杨宁等[21]采用氧化铝和C18 混合固相萃取小柱对腌菜中9 种N-亚硝胺净化，回收率在75.7%～116.1%。

为了建立快速、有效测定肉制品中N-亚硝胺的方法，本研究建立了UE-SPE-GC-NPD 和UESPE-HPLC-UV 测定肉制品中常见的N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亚硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲乙基亚硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丙基亚硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基哌啶（N-nitrosopiperidin，NPIP）、N-二丁基亚硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-二苯基亚硝胺（N-nitrosodiphenylamine，NDpheA）9 种挥发性N-亚硝胺的方法。采用超声振荡提取法结合固相萃取柱净化对样品进行前处理，优选超声波萃取条件和固相萃取柱的种类，为选择快速、简便，试剂消耗量少，精密度、准确度高的样品前处理方法，提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

鱼肉类油炸制品，购于当地超市。

N-亚硝胺混标（2 mg/mL）含有NDMA、NDEA、NMEA、NDBA、NDPA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPheA 9 种亚硝胺，美国Sigma 公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；超纯水，自制。

1.2 仪器与设备

Agilent1200 高效液相色谱，美国Agilent 公司；色谱柱VenusilRMP C18，博纳艾捷尔科技有限公司；真空抽滤装置，天津市津腾实验设备有限公司；Supelco 固相萃取装置，北京康林科技有限责任公司；HC-C18 固相萃取小柱、中性氧化铝（Alumina-N）萃取小柱、椰子壳活性炭萃取小柱（Coconut Charcoal），上海安谱实验室；K-D 浓缩仪，天津盛淼科技有限公司；GM-0.33A 隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司；STARTER 3100 pH 计，上海奥豪斯仪器有限公司；UVS-1漩涡振荡器，北京优晟联合科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液制备 9 种N-亚硝胺混标用100%甲醇配制成40 μg/mL 的标准储备液10 mL，置棕色瓶中于-20 ℃避光保存。将储备液稀释10 倍，配制成4 μg/mL 的N-亚硝胺混合标准品工作液，置棕色瓶中，于冰箱4 ℃冷藏保存。

1.3.2 样品前处理方法 用粉碎机将样品粉碎，称取肉样品20.0 g，置于50 mL 具塞离心管中，加入一定体积的二氯甲烷，于振荡器上涡旋1 min，保持温度在30 ℃以下，采用超声波提取一段时间，低温条件下离心5 min，倾出有机相溶剂。同样方法重复提取2 次，合并有机溶剂相，经无水硫酸钠脱水，于K-D 浓缩仪浓缩至5 mL，通过固相萃取技术净化萃取样品，用氮吹仪浓缩至近干，定容1.0 mL，用高效液相色谱仪检测样品中N-亚硝胺的含量。

1.3.3 高效液相色谱的检测条件 高效液相色谱的检测条件：采用VenusilRMP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，进样量20 μL，柱温25 ℃，UV检测波长240 nm，乙腈-水为流动相，采用梯度洗脱，洗脱方法见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table1 The gradient elution method of mobile phase

1.3.4 超声波提取条件优化 称取20 g 肉样品，在样品中加入1 mL 9 种N-亚硝胺混标（质量浓度为1 μg/mL），以二氯甲烷为提取试剂，采用超声波提取法优化样品前处理条件。

1.3.4.1 超声波提取时间的选择 固定二氯甲烷的体积为30 mL，提取功率为400 W，设定萃取时间分别为10，20，30，40 min 和50 min，研究萃取时间对9 种N-亚硝胺提取的影响。

1.3.4.2 超声波提取二氯甲烷体积的选择 固定超声萃取时间为20 min，超声提取功率为400 W，设定二氯甲烷体积分别为20，30，40 mL 和50 mL，研究二氯甲烷体积对9 种N-亚硝胺提取的影响。

1.3.4.3 超声波萃取功率的选择 固定超声波萃取时间为20 min，二氯甲烷的体积为40 mL，设定超声波功率分别为200，300，400 W 和500 W，研究超声波功率对9 种N-亚硝胺萃取的影响。

1.3.5 固相萃取柱的选择 将质量浓度为1 μg/mL 的9 种N-亚硝胺混标分别通过C18 柱、中性氧化铝柱和椰子壳活性炭柱3 种固相萃取小柱，然后用高效液相色谱仪检测标品，计算回收率。根据色谱图的出峰效果和回收率选择固相萃取小柱的种类。

固相萃取（SPE ）的萃取步骤：

1）活化 将6 mL 二氯甲烷以流速1 mL/min缓慢加入萃取小柱中。

2）平衡 用6 mL 甲醇以1 mL/min 的流速通过固相萃取小柱，再用6 mL 超纯水以1 mL/min的流速通过。

3）上样 平衡后立即将混合标品或超声波萃取的样品转移至固相萃取小柱，保持1 mL/min缓慢流出，保持固相萃取柱不被抽干。

4）洗脱 用真空泵将固相萃取柱负压抽干，取20 mL 色谱级甲醇作为洗脱剂，回收固相萃取小柱所吸附的N-亚硝胺，控制负压使甲醇以1 mL/min 流速洗脱。

1.3.6 UE-HPLC-UV 的回收率及精密度试验 根据1.3.4 节和1.3.5 节的研究结果，超声波提取的条件为：肉样20 g（分别加标的质量浓度为1，2 μg/mL 和4 μg/mL），加二氯甲烷提取试剂30 mL，超声波功率400 W，时间20 min。按此条件重复萃取2 次，将萃取液合并后，经K-D 浓缩仪浓缩至5 mL，过椰子壳活性炭小柱，用甲醇洗脱固相萃取柱，收集所有洗脱液，用氮吹仪浓缩至近干，定容1.0 mL，过0.22 μm 有机滤膜，装入样品瓶，用高效液相色谱仪测定。根据结果分析加标样品的回收率和相对标准偏差。

1.3.7 UE-GC-NPD 的回收率及精密度试验 前处理方法同1.3.6 节，最终将样品瓶内的样品上气相色谱仪测定。

1.4 数据统计分析

试验均重复3 次，结果用平均值±标准偏差表示。数据统计分析采用Statistix 8.1 软件包（St Paul，MN）中线性模型（Linear Model）程序进行方差分析，采用Tukey HSD 程序进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 超声波萃取时间对9 种N-亚硝胺萃取的影响

超声波萃取时间对9 种N-亚硝胺萃取的影响见图1所示。纵坐标表示9 种N-亚硝胺在色谱图上的峰面积之和。峰面积值越高，所检测的N-亚硝胺含量越高。在其它试验相同条件下（二氯甲烷体积30 mL，超声波萃取功率400 W），萃取时间10～50 min 范围，随着萃取时间的延长，峰面积值呈先上升后下降的趋势。在萃取时间10～20 min，峰面积呈直线上升；萃取时间25 min 时，峰面积达到最高值（2 817.67），与萃取20 min 时的峰面积值（2 807.56）比较，两者差异不显著（P＞0.05）。萃取25 min 后，峰面积迅速下降。分析其原因，可能是萃取在带盖的离心管中进行，盖的密封性不是很好，萃取超过25 min 后会出现N-亚硝胺挥发损失的现象。综合考虑后，选取20 min 作为最佳萃取时间。

图1 不同超声波提取时间对9 种N-亚硝胺萃取的影响Fig.1 Effect of different extraction time on 9 kinds of N-nitrosamines

2.2 超声波萃取试剂的体积对9 种N-亚硝胺萃取的影响

选择二氯甲烷作为萃取试剂，有机溶剂的用量影响样品中N-亚硝胺的萃取效果。图2显示二氯甲烷体积对9 种N-亚硝胺萃取的影响，试验结果仍以9 种N-亚硝胺在色谱图中的总峰面积值作为考察指标。在其它试验条件（超声波萃取时间20 min，超声波萃取功率400 W）相同的条件下，二氯甲烷用量在20～60 mL 范围，随着二氯甲烷用量的增加，9 种N-亚硝胺的总峰面积值整体呈明显的上升趋势。当二氯甲烷体积为20～40 mL 时，二氯甲烷用量与色谱图对应的总峰面积成正比。比较二氯甲烷体积为40，50，60 mL 时的总峰面积值，结果发现40 mL 与50 mL 的总峰面积值差异不显著（P＞0.05），40 mL 与60 mL 的总峰面积值差异不显著（P＞0.05）。为了节约有机试剂，选用40 mL 为最佳萃取体积。

2.3 超声波萃取功率对9 种N-亚硝胺提取效果的影响

超声波萃取功率对9 种N-亚硝胺提取的影响见图3。可以看出随着萃取功率（200，300，400W）的增加，9 种N-亚硝胺的总峰面积值显著增加（P＜0.05）。超声波萃取的功率越大温度越高，在使用功率500 W 萃取时，肉样品中的许多物质更易被萃取出来，导致样品萃取液过于粘稠，不能顺利通过固相萃取小柱净化。经比较，本试验选择400 W 作为最佳萃取功率。

图2 二氯甲烷用量对9 种N-亚硝胺萃取的影响Fig.2 Effect of different methylene chlorides on 9 kinds of N-nitrosamines

图3 不同超声波提取功率对9 种N-亚硝胺提取效果的影响Fig.3 Effect of different ultrasonic extraction power on 9 kinds of N-nitrosamines

2.4 固相萃取柱的选择

固相萃取柱有许多种，如C18 具有疏水作用，可去除油脂和非极性极强的干扰物。氧化铝是一类极性很强的吸附填料，性质接近硅胶。氧化铝在高pH 值条件下比硅胶更稳定，它通常用于去除芳香族和脂肪族的化合物。

图4 固相萃取小柱对9 种N-亚硝胺混标的HPLC 色谱图Fig.4 The HPLC chromatograms of 9 kinds of N-nitrosamines with SPE column

按照固相萃取柱的使用步骤，将质量浓度为1 μg/mL 的9 种N-亚硝胺混标分别通过C18 柱、中性氧化铝柱和椰子壳活性炭柱3 种固相萃取小柱，用高效液相色谱仪检测标品，结果见图4，分别为标品过固相萃取柱的色谱图——C18 柱（A）、中性氧化铝柱（B）和椰子壳活性炭柱（C）。根据色谱图中9 种N-亚硝胺的峰面积值对应标准曲线计算出3 种固相色谱柱的回收率（见表2）。

由图4可以看出，与图4a 和4b 相比，图4c中的色谱峰最为干净，说明活性炭小柱对杂质的去除效果较好。

从表2可以看出，活性炭柱的回收率最高，达66.76%～93.20%。在以下试验中选择椰子壳活性炭柱对超声波萃取的样品进行净化处理。王秀元等[19]、杨金川等[20]、夏晓楠等[22]也采用活性炭萃取小柱对样品进行净化，其回收率分别达到86%～99%，82.64%～98.24%和78.7～118.2%。蔡鲁峰等[23]采用高效液相色谱法检测肉制品中的9 种N-亚硝胺，采用C18 色谱柱分析，其相关系数均大于0.99，方法定量限为0.047～0.097 μg/g；回收率为72.6%～97.6%。

表2 3 种固相萃取小柱净化效果比较Table2 Comparison of three SPE cartridges used for purification of 9 N-nitrosamines

2.5 UE-SPE-HPLC-UV 方法的回收率及精密度

根据1.3.4 节的超声波萃取条件和1.3.5 节的固相萃取小柱的选择结果，在20 g 肉样中，分别加质量浓度为1，2 μg/mL 和4 μg/mL 的9 种N-亚硝胺的混合标准品，经超声波萃取、过椰子壳活性炭小柱，上机测定。加标样品的回收率和标准偏差见表3。

由表3可以看出，9 种N-亚硝胺的3 组加标水平试验回收率值在65.80%～94.20%范围，其精密度在1.19%～3.42%之间，说明UE-SPE-HPLC方法稳定，结果可靠，可以满足肉制品中痕量N-亚硝胺的测定。

表3 UE-SPE-HPLC-UV 方法的回收率和精密度Table3 The recovery and sensitivity of the UE-SPE-HPLC-UV

2.6 UE-SPE-GC-NPD 方法的回收率及精密度

由表4可以看出，9 种N-亚硝胺的3 组加标水平试验回收率值在66.80%～93.89%范围，其精密度均在1.39%～3.07%之间，说明UE-SPE-GCNPD 方法稳定，结果可靠，可以满足肉制品中痕量N-亚硝胺的测定。

表4 UE-SPE-GC-NPD 方法的回收率和精密度Table4 The recovery and sensitivity of the UE-SPE-GC-NPD

3 结论

本研究建立了一种超声波萃取、固相萃取净化结合高效液相色谱法和气相色谱法测定肉制品中9 种N-亚硝胺的分析方法。主要优化了超声波萃取的条件，并明确了固相萃取小柱种类对9 种N-亚硝胺分离检测效果的影响。采用二氯甲烷为提取溶剂，在400 W 的条件下超声波萃取20 min，对肉样品中9 种N-亚硝胺进行提取。选取活性炭萃取小柱净化提取的目标物，不仅减少了取样量，而且缩短了样品前处理时间。该前处理方法分别结合高效液相色谱法和气相色谱法，较GB/T 5009.26-2003 检测N-亚硝胺的方法更简单、快速，易于操作，重现性好。UE-SPE-HPLC-UV 法的回收率65.80%～94.20%，其精密度1.19%～3.42%；UE-SPE-GC-NPD 法的回收率66.8%～93.89%，其精密度1.39%～3.07%。这两种方法的实际样应用情况良好，适用于肉制品中N-亚硝胺物质含量的分析。