超声处理对黑豆蛋白与可溶性多糖复合物功能性质及结构的影响

朱 颖 吴隆坤 贾有青 李 哲 肖志刚

（1 沈阳师范大学粮食学院 沈阳110034 2 东北农业大学食品学院 哈尔滨150030）

黑豆，又名黑大豆、料豆，呈卵圆形或球形，豆皮呈黑色，在豆类中蛋白质的含量最高。黑豆不仅蛋白质含量高于黄豆，异黄酮、维生素E 等营养物质的含量也很高，素有“植物蛋白之王”的美誉[1]。研究表明黑豆蛋白的溶解分散性和乳化性以及乳化稳定性优越于大豆蛋白，而起泡性及起泡稳定性较差[2]。对黑豆蛋白的研究大多数是对其提取方法进行研究，如采用超声、微波等方法辅助提取黑豆蛋白[3-4]。黑豆蛋白提取率提高，可节约时间与能源。还有通过物理、化学和酶法等改变黑豆蛋白的空间结构和分子特性，从而改变蛋白的功能性质；通过研究大豆蛋白与可溶性多糖的相互作用机制，研究其影响大豆蛋白的乳化性、起泡性等功能特性。

研究表明，蛋白质可以通过静电吸引与糖类形成静电复合物，改变蛋白的表面电性，进而影响蛋白的乳化性能。樊雪静等[5]研究发现大豆蛋白与寡糖形成的可溶性复合物的溶解性、乳化性和乳化稳定性均得到提高。

超声波技术在各行业都有应用。超声波可分为两种：一种是功率超声波（低频率、高能量），另一种是检测超声波（高频率、低能量）。功率超声主要是进行超声治疗、超声雾化等。检测超声中的超声波主要作为信号使用。在食品行业中经常使用超声技术，如提取和分离、杀菌、干燥、乳化、检测等方面[6]。超声波技术为一种物理处理方法，被视为食品行业中“绿色加工”的发展需要，是当代食品行业研究中的新热点[7]。

通过研究黑豆蛋白与可溶性多糖的协同作用，研究二者的复合物在不同超声功率作用下的结合情况以及对黑豆蛋白功能性质及结构的影响，为黑豆蛋白的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆，东北农业大学大豆研究所；可溶性多糖，郑州荔诺生物有限公司；金龙鱼大豆油，市售。氢氧化钠，天津市光复精细化工研究所；盐酸，北京新光化工试剂厂；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，天津市东丽区天大化学试剂厂；其它试剂的最低纯度为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

LS-55 荧光分光光度计，美国PE 公司；UV-240IPC 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；JY92-IIN 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；LGR20-W 台式高速冷冻离心机，北京京立离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆蛋白的制备 黑豆蛋白的制备参考Wolf[8]的方法。将新鲜黑豆用磨粉机研磨成磨粉并过60 目筛，将得到的豆粉以1∶3 的比例与正己烷混合，置水浴锅中于40 ℃搅拌2 h，静置一段时间后倒掉上清液，即1 次脱脂，重复脱脂过程3 次。将豆粉与蒸馏水以1∶10 的比例混合，用NaOH 溶液将混合液的pH 值调至8.5，放在水浴锅中保持在45 ℃并用搅拌器搅拌2 h（在搅拌期间保持溶液的pH 8.5）。取出悬浮液在4 ℃、9 000×g 的条件下离心20 min，取其上清液用HCl 将溶液的pH值调节至4.5。放置一段时间后在4 ℃、6 000×g 条件下离心20 min，得到蛋白沉淀用蒸馏水洗2 次，最后用NaOH 将溶液的pH 值调节至7.0。将此溶液冷冻干燥后研磨即为黑豆蛋白。

1.3.2 黑豆蛋白与可溶性多糖复合物溶解性的测定 将所制备的蛋白与多糖按1∶1，1∶2，1∶3 的比例混合，溶解于蒸馏水中并调节溶液的pH 值为3.0。将溶液磁力搅拌3 h，加入0.02%的叠氮化钠。用Lowry 法测定可溶性蛋白含量。

1.3.3 黑豆蛋白与可溶性多糖复合物乳化性及乳化稳定性的测定 复合物的乳化性釆用Li 等[9]的方法测定。分别取9 mL 复合物溶液加入3 mL 的菜籽油，在室温（25 ℃）下用10 000 r/min 高速匀浆机均质1 min，快速取出50 μL 样品，用质量分数0.1%的SDS 溶液稀释250 倍，漩涡震荡混匀后用紫外分光光度计在波长500 nm 处测定吸光值A0。静置30 min 后用同样方法测定吸光值A30。乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）计算公式如下：

式中：A0——最初的乳化液在500 nm 处的吸光值；C——乳化液形成之前蛋白质水溶液中蛋白质的质量浓度（g/mL）；Φ——菜籽油占乳化液的体积分数（φ=0.25）；A30——乳化液静置30 min 后的吸光值。

1.3.4 黑豆蛋白与可溶性多糖复合物起泡性及气泡稳定性的测定 称取0.605g tris 溶于50 mL 蒸馏水中，用2 mol/mL HCl 溶液调节pH 值为8.5，分别取复合物溶液2 mL 于试管中，各加入8 mL tris-HCl 缓冲液，用高速分散机均质1 min。将均质后的溶液快速转移到25 mL 量筒中，每隔一段时间记录泡沫的体积，通过观察泡沫体积和静置稳定后的泡沫体积来评定样品的起泡性（FC）和泡沫稳定性（FS）。计算公式为：

式中：V0——起泡0 h 时的泡沫体积/mL；Vt——起泡t h 后的泡沫体积/mL；Vi——起泡前最初液体的体积/mL。

1.3.5 超声处理对复合物理化性质的影响 黑豆蛋白与可溶性多糖以1∶2 的比例混合，溶解于蒸馏水中，调节溶液的pH 值为3.0，磁力搅拌溶液3 h 后，将复合物放在冰水浴中，将超声探头浸入液面以下2 cm 的位置，选用工作时间5 s，间隔时间5 s 的操作方法在特定超声功率400 W[10]下分别超声处理8，16，24 min，在波长500 nm 处测定超声后3 种样品的乳化性质及起泡性质。

1.3.6 荧光光谱测定 采用荧光光度计测定超声处理后的蛋白-多糖复合液，将3 种样品稀释10倍后放入试管中。荧光光谱的激发波长为290 nm，扫描发射光谱范围250～400 nm，扫描的速度60 nm/min，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm。

1.3.7 圆二光谱测定 在远紫外区域进行圆二光谱测定，探究超声对蛋白质二级结构的影响。称取一定量超声处理后的样品，溶于pH 7.0 的磷酸盐缓冲溶液中，蛋白质质量浓度为0.4 mg/mL。圆二光谱在200～300 nm 之间扫描，试验温度20 ℃，样品池的光学长度1 mm，敏感度100 med g/cm，扫描速度100 nm/min，分辨率0.1 nm。

1.3.8 统计分析 每个试验重复3 次，通过SPSS2.0 软件分析数据，采用SigmaPlot 12.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同比例黑豆蛋白-可溶性多糖复合物理化性质比较

2.1.1 对溶解性的影响 将各标准溶液和待测液分别用紫外分光光度计测定其吸光度，绘制标准曲线，列出方程。该标准曲线的方程为y=0.448x-0.0083，回归系数R2= 0.9908，线性良好，可以通过标准曲线计算复合物中蛋白质的浓度。

将所测吸光度值带入方程，得到3 种待测的蛋白浓度分别为0.36，0.29，0.49 mol/L。由此得知将大豆分离蛋白与可溶性多糖以1∶3 的比例混合时得到的复合物的蛋白溶解性最好。

2.1.2 乳化性质比较 将样品溶液加入菜籽油后均质1 min，取样加入SDS 溶液稀释，在波长500 nm 处测定它的吸光值。分析图1发现，1∶1 复合物的乳化性最差，1∶2 的复合物的乳化性最好。这是因为多糖的存在使蛋白的乳化性增加，多糖可与溶液中的蛋白质发生反应，其中接枝的多糖所具有的空间位阻作用抑制了乳液液滴间的凝集，使乳液的稳定性提高[11]。

将测定乳化性后的溶液静置30 min，在波长500 nm 处测定其吸光值。分析图1发现，1∶1 复合物在16.5 min 内的乳化稳定性较好，而1∶2 复合物在27.8 min 内乳化稳定性最好。这是因为黑豆蛋白中的蛋白质与多糖形成的共价接枝物所具有的物理化学性质，尤其是疏水和亲水特性，使它们能够稳定泡沫体系[12]。

2.2 不同超声处理时间对复合物的影响

2.2.1 乳化性质的变化 经分析，以1∶2 的比例混合时，蛋白与多糖复合程度较好。选用1∶2 的复合物进行相应试验处理。选用工作时间4 s，间隔时间4 s 的操作方式，在一定的超声功率下分别处理8，16，24 min。在波长500 nm 处测定它的吸光值。对图2进行分析，发现超声处理均不同程度地提高溶液的乳化性。不同的超声处理使溶液发生物理振荡，破坏分子结构，分离蛋白发生部分展开并在油-水界面聚集，降低了溶液的表面张力，从而使乳化性有一定的提高[13]。超声处理16 min 时，乳化值达到最大值。可能是因为超生处理时产生的空化和机械作用，使可溶蛋白成分中的4 级结构发生改变，短时间内释放出小分子多肽分散到溶液中，增加复合物的溶解性，乳化性随之增加。而随着超声时间的延长，产生的能量不能使这些小分子分散，分子间出现聚集，乳化能力下降。

将测定乳化性后的溶液静置30 min，在波长500 nm 处测定其吸光度。根据图2，超声处理时间对复合物的乳化稳定性影响较大，可能是由于超声处理使蛋白质结构变得疏松，有利于吸附在水-油界面。超声处理使复合物的乳化稳定性有一定提高。

图1 不同比例黑豆分离蛋白-可溶性多糖复合物的EAI 和ESIFig.1 EAI and ESI of different black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

图2 不同超声处理时间的黑豆蛋白-可溶性多糖复合物的EAI 和ESIFig.2 EAI and ESI of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

2.2.2 起泡性质的变化 复合物经高速搅拌后，大量的气体进入溶液中形成水-空气界面，溶液表面张力降低后形成泡沫的能力即此复合体系的起泡性[14]。起泡性的变化与其溶液中蛋白结构和物理化学性质的变化有关。超声处理有助于将蛋白质分子解聚成小分子亚基，同时暴露了蛋白质的疏水基团，增加了气-水界面蛋白分子数目和与磷脂疏水结合的程度，从而不同程度地提高了起泡能力[15]。分析图3，随着超声处理时间的增加，蛋白质分子结构打开更完全，分子间重新聚集形成更大的聚集体，表现为溶液表面膜的稳定性下降，从而起泡能力下降[16]。

分别取不同处理时间的混合溶液2 mL，加入8 mL pH 8.05 的0.05 mol/L Tris-HCL 缓冲液。室温下用高速分散机均质1 min，快速将溶液转移至25 mL 量筒中，每隔30 min 记录泡沫的体积。计算复合液的起泡性。分析图4，随处理时间的延长，泡沫稳定性均有所下降。

图3 不同超声处理时间的黑豆蛋白-可溶性多糖复合物的FCFig.3 FC of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

图4 不同超声处理时间的黑豆蛋白-可溶性多糖复合物的FSFig.4 FS of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

2.3 复合物的荧光分析

荧光光谱是一种可以反映蛋白质3 级结构构象变化的灵敏且有效的方法。λmax大于280 nm。蛋白质在多糖和超声的双重作用下构象发生改变。高强度超声波处理后蛋白质分子发生一定的聚集，形成不溶性的蛋白质，并且随着超声时间的延长，蛋白质分子解聚成新的大分子物质[17]，与可溶性多糖间的作用减弱。与此同时，多肽链及氨基酸残基变化幅度较小，说明超声对黑豆蛋白-可溶性多糖复合物之间的作用影响较小，而发色基团暴露在蛋白质聚集体外侧使其荧光性又有一定程度的升高。

图5 不同超声处理时间的大豆分离蛋白-可溶性多糖复合物的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectrum of different ultrasonication-treated time of soybean protein isolate and soluble polysaccharide complexes

2.4 圆二光谱分析

圆二光谱显示超声处理对黑豆蛋白二级结构的影响。利用CD Pro 拟合软件对图谱进行分析计算，得到黑豆蛋白二级结构的变化情况，见表1。当超声功率为400 W 时，随着超声时间的延长，黑豆蛋白中的α-螺旋含量上升，β-折叠下降，24 min 时变化较为明显，这可能是功能性质差异的原因。二级结构的变化与Chandrapala 等[18]的研究结果相同。由于蛋白质的二级结构主要由氨基酸序列及其相互作用决定，上述结果可能表明超声处理破坏分子间相互作用，导致蛋白质柔性结构的变化。与此同时Hu 等[19]在研究中发现不仅超声时间对蛋白结构的影响较大，在不同超声功率下蛋白二级结构的变化也存在差异。

表1 超声处理后黑豆蛋白的二级结构的变化Table1 Secondary structural content of native and ultrasonication-treated black soybean protein estimated from circular dichroism spectra in the far-UV region

3 结论

采用超声波处理的方法探究一定的超声功率下不同超声时间对黑豆蛋白与多糖复合物的功能性质及结构的影响。结论如下：1）将黑豆蛋白与可溶性多糖以1∶3 的比例复合时，复合物中蛋白的溶解性最好；2）当蛋白与多糖以1∶2 的比例复合时，复合物的乳化性和乳化稳定性最好；3）超声处理复合物时，处理时间为16 min 的混合液的乳化性最好，处理时间为8 min 的复合物的乳化稳定性最好，而处理时间为24 min 的复合物的乳化稳定性最差；4）随着超声时间的延长，蛋白质二级结构中α-螺旋含量上升，β-折叠下降，导致柔性区间变化，说明蛋白质的结构与功能性质密切相关。