不饱和脂肪酸经氧化反应形成反式脂肪酸机理研究进展

姚梦莹 梁 倩 崔岩岩 黄午阳 郑晓燕 张伟敏

(海南大学食品科学与工程学院1，海口 570228)(江苏省农科院农产品加工研究所2，南京 210014)(中国热带农业科学院海口实验站3，海口 570101)

食用油中顺式不饱和脂肪酸在热加工过程中可经异构化反应形成反式脂肪酸(trans fatty acids, TFAs)[1，2]。食用油中TFAs种类和含量在160～240 ℃内随温度的升高和时间的延长而呈指数增加趋势[3-5]。众多研究表明，膳食TFAs与糖尿病、心血管疾病、肥胖、乳腺癌、前列腺癌、不孕和冠心病等疾病密切相关[6]；大量食用含有TFAs 的食物会阻碍必需脂肪酸在人体内的正常代谢、妨碍脂溶性维生素的吸收和利用、使细胞膜的结构变得脆弱、加速动脉硬化等多种危害[7-11]。随着对 TFAs 危害认识的深入，欧美等国家对 TFAs 加以限制，制定膳食中限量标准。因而，有效控制食用油热加工过程中TFAs 的产生成为亟需解决的难题，且对于提升食品安全水平和保障消费者健康至关重要。

1 TFAs特点与影响因素

如油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甘油三酯在160～220 ℃加热条件下生成TFAs含量随加热温度升高和加热时间延长而逐渐增加[19]。大豆油、菜籽油和葵花油等植物油也发现了类似的结果[20-23]。此外，TFAs的形成与不饱和脂肪酸组成、含量、结构、饱和度及碳原子数目多少有关。其中不饱和度越高TFAs越易形成；当碳原子数目、不饱和度相同时，反式异构数量越少、对称性越高的TFAs 越容易产生[24]。

2 不饱和甘油三酯氧化产生反式结构的反应机理

油脂中不饱和脂肪酸的氧化反应又可分为自动氧化和热氧化两种，自动氧化和热氧化二者反应机理相同[25]。但两种反应发生的过程、反应速度和产物则不尽相同。一般而言，100 ℃以下以自主氧化反应为主；100～200 ℃则会加速氧化反应，并伴随热异构化反应(150 ℃条件就有TFAs产生)[26]；温度在 200～300 ℃时则以热聚合反应为主，而热分解反应在260 ℃以下不明显，在350 ℃以上时反应速度会明显加快[27]。

2.1 不饱和甘油三酯自由基反应(加成-消除反应)产生反式脂肪酸机理

早期的研究证明，不饱和脂肪酸在含硫自由基(RS*)、烷基自由基(ROO*)等自由基在催化作用下可通过自由基反应机制发生双键的顺/反异构化[28,29]。X*与双键经α-加成和β消除反应生成π键，最后生成热稳定的反式异构体(图1)，反应过程中会形成一个由外源自由基和不饱和脂肪酸组成的加合物[29]。不饱和脂肪酸在自由基的催化作用下亦可以通过自由基反应机制发生双键的顺反异构化产生TFAs。反式异构化速率与顺式热降解速率呈正相关，热致异构化反应与热氧化降解产生的中间物质和氧化过程有关[11,30,31]。

图1 自由基催化顺式/反式异构化反应机制

图2 双自由基过渡态反应机制[33]

2.2 不饱和甘油三酯自动氧化产生反式结构的反应机理

从油酸甲酯自动氧化生成过氧自由基的机理可以看出(图3)，油酸顺/反异构化反应理论计算和实验证明，氧气是发生油酸顺/反异构化反应的必要条件，R—O—O—H 均裂的活化能为160.97 kJ/mol，是油酸顺/反异构化过程的决速步骤，并从油酸角度阐明了不饱和脂肪酸发生氧化反应形成自由基经过β均裂产生TFAs的理论机制[34]。Porter等[35]对油酸甲酯自动氧化生成过氧自由基机理的研究表明，油酸发生顺/反异构化过程中，8t、9t、10t及11t结构均有产生，这些反式异构体的产生及产量受到加热、温度和时间等诸多因素的影响。同理，TFAs也是亚油酸和亚麻酸热氧化分解反应中的常见氧化产物。只不过生成TFAs更容易，产物更复杂，除了有TFAs之外，还伴随有经环化反应形成的一环和二环脂肪酸单体等产物[36]。目前关于不饱和脂肪酸在高温条件下生成环状脂肪酸的化学机制最为成熟的解释是热引发[1,6]或[1,7]质子异变迀移协同的环加成作用[36]。和油酸类似，亚油酸也是通过自由基链式反应机制和1, 3-单键转移重排(分子内)可以解释亚油酸在高温条件下形成9t、11t亚油酸和成10t、12t式亚油酸，只是亚油酸比油酸相对更容易形成反式亚油酸[37,38]。由于本研究主要侧重于对不饱和脂肪酸形成TFAs机制的探讨，因而对不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸和α-亚麻酸)在发生顺/反异构化过程经高温反应形成环状脂肪酸的具体化学机制不做过多赘述。

注：Rc H 是油酸， Rt H 是反式油酸， H 是与双键相邻的α -亚甲基的氢原子。图3 油酸自动氧化产生反式结构的反应机理

3 热致异构化反应机理的密度泛函理论计算

3.1 密度泛函理论可开展酚类抗氧化剂活性理论分析

化学反应过渡态理论认为，不饱和脂肪酸热致异构化过程形成的过渡态性质非常活泼，存在时间极短，从实验获得它的结构和性质等数据很难[5]。而量子化学密度泛函理论则为不饱和脂肪酸热致异构化机制研究提供了可能，并在分子反应机理和过渡态的处理上体现出了无与伦比的优越性[16,39-43]。近年来，国内外学者报道了利用量子化学手段研究不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸和亚麻酸)的顺反异构化机制[5,16,38,42]。

3.2 不饱和脂肪酸氧化脱氢反应能量的量子化学计算

食用油中不饱和脂肪酸或甘油酯中的α碳上的氢原子发生脱氢而在起始阶段产生脂烷基自由基。十八碳一烯酸(油酸)有2个α碳原子(即C8和C11)；十八碳二烯酸(亚油酸) 应当有3个α碳原子，即C8、C11和C14，但是由于C11受到两个双键的影响，它的活性要比C8和C14要强得多；作为十八碳三烯酸(亚麻酸) 有4个α碳原子，结果氧化反应将受C11和C14的支配。热、金属催化剂、紫外线和可见光可以加速脂肪酸或甘油酯自由基形成，从脂肪酸或甘油酯中脱氢所需的能量取决于分子中氢的位置。

表1 脂肪酸自动氧化形成的氢过氧化物[47]

3.3 不饱和脂肪酸热致异构化理论机制量子化学计算

众多研究表明，不饱和脂肪酸甘油三酯经产生自由基(α-自由基)而使双键发生cis/trans异构化，主要包含直接异构化和质子转移异构化2种反应机理[30,36,48]。Li等[21]利用量子化学密度泛函理论(DFT)对油酸(C18∶1)经质子转移途径的cis/trans异构化反应机制的理论推理和试验结果表明，顺式油酸在145.46 ℃下发生了焓变(放热现象)，顺式和反式油酸基态能量差为7.6 kJ/mol，其值低于顺式和反式亚油酸(C18∶2)能量差(13.2 kJ/mol)。油酸发生顺/反异构化的过渡态能垒为294.5 kJ/mol，其值大于亚油酸(284.2 kJ/mol或286.4 kJ/mol)[21]。李安[5]对油酸顺反异构化反应理论的研究表明，油酸异构化按照直接异构化反应理论包含1种过渡态和1条途径。Cheng等[34]对油酸顺/反异构化反应理论计算和实验证明，油酸顺/反异构化反应需要氧气参与并可能开始于150 ℃，从油酸角度阐明了不饱和脂肪酸发生氧化反应形成自由基经过β均裂(ROOH均裂的活化能为160.97 kJ/mol)产生TFAs的理论机制。Tsuzuki[22]的研究也证实了这一理论机制。按照直接异构化反应理论，顺式亚油酸需克服236.9 kJ/mol以上的能垒形成双自由基渡态，且反式双键越多，所需克服的能垒数量越多；反应温度越高，速率常数越大。而按照质子转移异构化理论，单一反应途径需克服286.4 kJ/mol的能垒，过渡态中间产物为一个包含3个碳原子和4个氢原子的π34离域体系[5]。根据质子转移异构化机理，亚麻酸分子中的氢原子向相邻的碳原子转移形成过渡态产物，单独的反应途径需要达到 290.4 kJ/mol 的能量，包含有3个过渡态和1个中间体，过渡态的中间产物体系为一个具有4个氢原子和3个碳原子的大离域体系[5,16]。

4 热致异构化反应途径与动力学

4.1 热致异构化反应途径和模式

不饱和甘油三酯的双键在高温氧化反应过程中会发生断裂所生成烯丙基自由基有可能成为TFAs形成的底物。理论上，不饱和脂肪酸在加热条件下，随着热致异构化反应的发生，会按顺序先生成单式异构体，再生成双反式异构体，最后生成三反式的异构体，形成一定分布情况的顺反异构化产物(反式油酸、反式亚油酸、反式亚麻酸)[16,17]。李安[5]研究表明，顺式油酸分子的碳碳双键经一种过渡态、一条途径进行了非迁移的顺反异构化形成了反式油酸；亚油酸热致异构化按照直接异构化反应理论包含4个过渡态和2条途径。亚麻酸热致异构化反应根据直接异构化的反应机理，亚麻酸异构化反应需要包含6条途径和12种过渡态[5,16]。贺凡[17]研究证实，亚油酸热致异构首先形成单反式 C18∶2-9c12t和 C18∶2-9t12c异构体，再形成双反式 C18∶2-9t12t异构体。姜帆[16]实验表明，α-亚麻酸甘油三酯热致异构途径是：先形成C18∶3-9t, 12c, 15c、C18∶3-9c, 12t, 15c、C18∶3-9c, 12c, 15t单反式异构体，再形成C18∶3-9c, 12t, 15t、C18∶3-9t, 12c, 15t、C18∶3-9t, 12t, 15c双反式异构体，最后形成C18∶3-9t, 12t, 15t三反式异构体。通过以上研究初步阐明了不饱和甘油三酯热致异构化的反应途径和模式。

4.2 热致异构化反应动力学

图4 不饱和脂肪酸顺反异构化反应能量途径(油酸)

5 抗氧化剂抑制TFAs形成作用

不饱和脂肪酸热致异构化反应由温度主导，不饱和脂肪酸双键在常温下相对稳定而很难发生顺/反异构化，而在足够高温度下则相对容易[56]。不饱和脂肪酸在 160～220 ℃条件下产生TFAs的含量随加热温度升高和加热时间延长而逐渐增加[17,19]。理论上，调控加热温度和缩短加热时间是降低 TFAs 含量最简单直接而又最有效的方法，以往有关抑制TFAs的方法主要集中在其形成抑制方面，尤其是在热加工过程中如何采取各种措施以降低食品中TFAs的含量，如原料的改良、添加剂的使用、优化加工工艺、改进加工方法和设备等方面。但实际加工过程中当温度过低或处理时间不够会降低食品的感官品质(色泽、风味、质地和口感等)和安全性[17]。通过分析发现，不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸和亚麻酸)热致异构化反应属于自由基反应，其中无论是自由基反应(自由基催化顺式/反式异构化、双自由基扭转)、直接异构化还是质子转移异构化，其过渡态均包含自由基或者类似自由基的结构。因而，在不改变加热温度和加热时间的前提下，目前普遍认为延缓和预防油脂的氧化酸败工作量最低、最有效和最常见的方法是在油脂中添加抗氧化剂，以消除痕量自由基，阻止链式反应的进行，进而防止油脂氧化和TFAs产生。

Elisia等[58]研究认为抗氧化剂中的羟基通过提供氢原子与酯自由基结合形成更稳定的产物，从而阻止酯自由基链的持续氧化，实现降低甘油三酯热致异构过程形成的过量酯自由基，从而中断或抑制自由基引起的油脂自动氧化反应。因而添加自由基清除剂可抑制热致异构化反应产TFAs[18]，而且抗氧化剂清除自由基能力越强，对TFAs 的抑制程度也越大[31]。目前普遍认为延缓和预防油脂的氧化酸败工作量最低、最有效和最常见的方法是在油脂中添加抗氧化剂，以消除痕量自由基，阻止链式反应的进行，进而防止油脂氧化和TFAs产生。传统的人工合成抗氧化剂丁基羟基茴香醚(Butyl hydroxy anisol, BHA)、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚 (Butylated hydroxytoluene, BHT)、特丁基对苯二酚(Tertiary butyllhydroquinone, TBHQ)和没食子酸丙酯(Propyl gallate, PG)均在食用油中具有较好的抗氧化和抗异构化效果[19,26,27,30,31]。但这些人工合成抗氧化剂具有潜在毒性甚至致癌，许多国家已禁止使用[60]。因此，从植物资源中寻找安全高效和热稳定性好的天然TFAs抑制剂是目前重要的发展方向和研究重点。近年来，维生素E(VE)、迷迭香提取物、茶多酚、芝麻酚、叶黄素、鼠尾草酸、茶多酚、谷维素和儿茶素等天然抗氧化剂均可有效抑制TFAs的形成[17,19,30,61]。然而有报道称，维生素E、茶多酚和谷维素等多数天然抗氧化剂在高温加热条件下对TFAs形成的抑制作用效果并不理想，有些甚至还会对热致异构产物具有诱导作用[5,17]。如茶多酚低于160 ℃稳定性较好，随着温度的升高，其稳定性显著下降[62]；茶多酚、VE、VC、BHT和BHA 等常用抗氧化剂在约200 ℃高温条件下的抗氧化效果明显下降，而CA还能发挥稳定的抗氧化性能[63]。TBHQ、茶多酚、阿魏酸乙酯和谷维素在高温240 ℃加热条件下对热致异构产物具有诱导作用[17]。贺凡[17]的研究结果显示鼠尾草酸对TFAs(C18∶2-9c12t、C18∶2-9t12c和tt-CLAs)的形成具有显著抑制作用但不影响CLAs的生成，可作为油脂热致异构化调控的选择[17]。究其因，可能是因为多数天然抗氧化剂热稳定性较差，在食用油热加工过程初期就发生了氧化降解，很难在食用油热致异构化反应中清除活性羰基类化合物、活性氧族和脂质自由基，阻断TFAs的生成途径。

6 结束语

由于热致异构化通常在较高温度(150 ℃及以上)下发生，并非具有抗氧化作用的天然活性物质一定具有抗异构化作用。若要有效控制热致异构化反应，天然TFAs抑制剂必须具备耐高温、清除自由基活性强和对食品品质影响小等特点。贺凡[17]研究结果表明，抗氧化剂对热致异构化反应抑制作用与抗氧化活性成分的羟基氢、热稳定性、结构和不饱和脂肪酸甘油三酯结构及双键的含量有关[17]。

目前鲜见关于利用密度泛函理论研究抗氧化剂抑制不饱和脂肪酸异构化反应机理的报道，有关密度泛函理论对鼠尾草酸、茶多酚、酚羧酸、维生素 E及合成抗氧化剂 BHA、BHT等典型的天然和合成酚类抗氧化剂以及黄酮类化合物清除自由基机理和不饱和脂肪酸异构化机理的研究较多[5,38,42,46,65]，这些报道和研究为利用抗氧化剂抑制TFAs的形成提供了思路和借鉴。今后可以考虑从天然活性成分中寻找耐高温、清除自由基活性强和对食品品质影响小的抗氧化剂，在此基础上，进一步考虑从动力学和能量角度出发，结合密度泛函理论研究抗氧化剂抑制TFAS形成机制。此外，油脂热降解、热聚合和热环氧化等反应所产生油脂危害物质(3-氯丙醇酯、缩水甘油酯、丙烯酰胺、极性物质、苯并芘、呋喃和2-烷基呋喃等)物质直接或间接与油脂热氧化反应相关，可以考虑加强对抗氧化剂抑制这些油脂热加工过程产物形成作用研究，以便为油脂热加工过程产物调控机制研究提供参考。