多杀性巴氏杆菌NarQ-NarP信号传导系统的作用初探

【摘 要】目的 本研究旨在探究血清A型多杀性巴氏杆菌中NarQ-NarP双组份信号转导系统是否具有调控硝酸盐代谢的作用。方法 用硝酸盐还原实验检测多杀性巴氏杆菌是否具有还原硝酸盐的能力;然后将血清A型多杀性巴氏杆菌在含有不同浓度硝酸盐的培养基上培养，提取培养液总RNA，用实时荧光定量法测定narQ、narP在转录水平的表达量，并用相对定量分析法比较了多杀性巴氏杆菌NarQ-NarP双组分系统在不同硝酸盐浓度下基因转录水平的变化。结果 不同浓度硝酸盐对narQ、narP的表达量均产生了不同程度的影响。结论 血清A型多杀性巴氏杆菌的NarQ-NarP双组分系统与硝酸盐的代谢密切相关。

【关键词】多杀性巴氏杆菌;NarQ-NarP;硝酸盐

巴氏杆菌是一种广泛分布于世界各地的细菌，由巴斯德氏在1880年首先自病鸡分离得到。巴氏杆菌病是一种由巴氏杆菌属细菌引起的一种急性、热性、畜禽共患的传染病，危害极大。而引起该病的主要病原体细菌就是其中的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida），也是本属中对畜禽的危害中表现最为严重的一种，同时该菌也能感染人类，因此一直受到社会的广泛关注[1]。

细菌的生存离不开信号转导，双组份系统是广泛存在于细菌中的一种信号转导体系，在大肠杆菌中第一次被发现，后续大量的研究表明该系统对细菌的生长、分化、代谢、繁殖等都有不同程度的调控作用[2]。但是在目前已有的研究中，有关巴氏杆菌的双组份信号转导研究很少。前期基因组测序及数据库比对显示，巴氏杆菌中存在着多组双组份系统，且存在着与大肠杆菌结构类似的能够调控硝酸盐代谢的NarQ-NarP二元双组份信号转导系统。本研究先用硝酸盐还原实验明确了牛源A型多杀巴氏杆菌具有还原硝酸盐的能力，然后在巴氏杆菌培养基中添加不同浓度硝酸盐，在此基础上检测该多杀性巴氏杆菌的NarQ-NarP双组份信号转导系统的两个构成元件narQ、narP在转录水平上的变化，研究结果表明该信号系统与环境中硝酸盐浓度变化具有密切关系。

1 材料与方法

1.1 材料

重庆某奶牛场分离得到的牛源A型多杀性巴氏杆菌血清强毒株。

1.2 主要试剂

①生物工程有限公司生产的narQ、narP引物

②Invitrogen公司生产的16s引物

③硝酸盐还原生化管

④马丁氏肉汤

⑤康为世纪公司的Ultrapure RNA Kit（超纯RNA提取试剂盒）、HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit（HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒）

⑥BIO-RAD公司的SsoFast EvaGreen Supermix及Optical Flate 8-Cap Strips for 0.2ml tube strips

1.3 试验方法

1.3.1 硝酸盐还原实验

将培养的牛源A多杀性巴氏杆菌接种于硝酸盐还原生化管中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时或以上，同时以一支接种等量灭菌生理盐水的培养基做空白对照。

1.3.2 不同浓度硝酸盐和亚硝酸盐培养基的配制

在配制好的马丁肉汤中分别添加终浓度为0g、0.25g、0.5g、0.75g、1.0g、1.25g、1.5g的硝酸盐，每个培养基中后续提取的总RNA样品分别标记为0、1、2、3、4、5、6号样品。

1.3.3 RNA的提取

按Ultrapure RNA Kit操作步驟提取细菌培养液中总RNA，并用核酸检测仪测定每个样品所提取的总RNA浓度和纯度。

1.3.4 反转录

按康为世纪公司的HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit操作步骤去除基因组DNA（反应体系见表F1，反应条件42℃孵育2min），并对RNA进行反转录（反应体系见表F2，反应条件42℃孵育15min，85℃孵育5min，然后-20℃保存）。

1.3.5 荧光定量PCR

①选择多杀性巴氏杆菌16s为内参纠正上样量的误差。

②RT-PCR 反应体系如下表F3：

③样品：为了保证实验的准确性，每个不同硝酸盐浓度下样品的每一个基因（narQ、narP、16s）设置了3个重复数。

④荧光定量PCR，约1.5h。

1.3.6 相对定量法

该法用来分析荧光定量PCR数据，即通过Cq值来确定目的基因的表达差异倍数，Cq值是指扩增过程中荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。该方法假定目的基因和内参的表达为1，当相对表达倍数大于1时，表示处理后的样品该基因表达量增加，反之，则表达量减少。

2 结果

2.1 硝酸盐还原试验

硝酸盐还原试验中，试验生化管中的液体变为红色，呈阳性反应;空白对照管的结果呈阴性，液体颜色无任何变化。结果如下图J1。

2.2 RNA的提取

各提取样品RNA浓度测定结果见表J1。

2.3 荧光定量PCR

各样品的荧光定量PCR的平均Cq值见表J2。

根据荧光定量PCR相对定量法计算公式，由以上编号1的样品narP基因计算公式为：

根据以上计算方法，将narP、narQ在不同硝酸盐浓度培养基中的相对表达倍数呈现于表J3中。

由表J3做柱形图如下（图J2）：

3 讨论

3.1 多杀性巴氏杆菌硝酸盐还原能力的测定

某些细菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘胺结合生成N-α萘胺偶苯磺酸，呈现红色[4]。在实验中，生化管中液体呈现红色，为阳性，故该牛源A型多杀性巴氏杆菌具有还原硝酸盐的能力。

3.2 不同浓度硝酸盐条件下narQ、narP基因表达量的测定

由图J2可以看出，在不同浓度硝酸盐培养基中，narQ、narP基因的表达量随硝酸盐浓度的不同而改变。当环境中硝酸盐浓度在0.75-1.25 g/L时，narQ、narP基因的表达量处于一个较低水平，这可能是多杀性巴氏杆菌比较适应的硝酸盐浓度范围;当环境中硝酸盐浓度过高或过低时，narQ、narP基因的表达量均开始上升，以此调控环境中太高或太低的硝酸盐浓度，使细菌通过双组分信号转导系统来适应变化了的环境，这与原荣荣等报道的在大肠杆菌中NarQ-NarP信号系统具有调控下游与硝酸盐相关的基因 的功能相一致[5]。图J2还表明，narQ、narP这对双组分元件在不同浓度的硝酸盐环境中，其上调或下降表达的趋势是一致的，说明这两个元件在多杀性巴氏杆菌的生长、代谢过程的作用是相辅相成、共同作用，这与尧可等报道的典型的双组份信号系统通常包括组氨酸激酶和反应调节蛋白，这两个蛋白凭借其特殊的结构域同时发挥接受磷酸基团和调节下游分子的作用机制相一致[6]。

3.3 结论

牛源A型多杀性巴氏杆菌具有硝酸盐代谢的能力，在硝酸鹽代谢的过程中，该菌的NarQ-NarP双组份信号转导系统与硝酸盐代谢密切相关。

参考文献：

[1]高娃，林靖凯.猪巴氏杆菌病[J].国外畜牧学（猪与禽），2014，34（1）：14-26.

[2]米国华，赖宁薇，陈范骏，等.细菌、真菌及植物氮营养信号研究进展[N].植物营养与肥料学报，2008，5（14）：1008-1016.

[3]康永凯，贾永义.荧光定量PCR数据处理方法的探讨[J].生物技术，2008，3（18）：89-91.

[4]胡桂学，陈金顶，彭远义. 兽医微生物学实验教程[M]. 第2版. 中国农业大学出版社，2015.

[5]原荣荣，夏远.大肠杆菌信号转导系统研究进展[J].绿色科技，2013-6（6）：310-314.

[6]尧可，蔡靖仪，赵蕾等.牙龈卟啉单胞菌双组分信号转导系统的研究进展[J]. 华西口腔医学杂志，2021-39（01）：88-93.

作者简介：

黄兰香（1972-），女（汉族），湖南常德人，博士，任职于西南大学动物医学院，副教授，研究方向：主要从事动物微生物学与免疫学的教学科研工作。

基金项目：

1.重庆市基础与前沿研究计划项目（cstc2015jcyjA80021），项目名称：牛A型巴氏杆菌NarQ-NarP调控系统缺失株的构建及其生物学特性研究;

2.西南大学基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013C015），项目名称：牛巴氏杆菌A型与B型荚膜亚单位疫苗的比较研究。

（作者单位：西南大学动物医学院）