海水中硝酸盐的无阀连续流动分析

林坤宁　马剑　袁东星　黄勇明　冯思超　吴巧玲

摘要建立了一种无阀连续流动分析方法和装置，仅用一台多通道蠕动泵传送试剂和样品，无需依靠注入阀、电磁阀和定量环进行试剂或样品的选择和定量输入。样品通过铜镉还原柱，将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后用重氮偶氮光度法进行测定。研究结果表明，硝酸盐的线性范围为5～180 μmol/L，方法检出限为0.27 μmol/L，对10 和80 μmol/L硝酸盐溶液连续测定11次，相对标准偏差分别为1.4%和1.3%，不同盐度的实际水样加标回收率在99.4%～106.1%之间。测定结果与流动注射分析法相比，无显著性差异。与流动注射分析相比，无阀设计装置大大降低了成本，操作更加简便，有利于在普通实验室或现场连续监测中推广使用。本方法成功应用于厦门西港海水样品中硝酸盐的测定以及九龙江河口区的硝酸盐走航式监测。

关键词 无阀； 连续流动分析； 海水； 硝酸盐

1引 言

硝酸盐作为一种常见的营养盐，广泛存在于各种水体中。过多的硝酸盐进入水环境，会导致水体富营养化[1]，因此检测海水中的硝酸盐含量具有重要意义。《海洋监测规范》中规定，利用手工操作将样品通过铜镉还原柱，将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后以重氮偶氮光度法进行测定[2]。该方法的还原效率高，但操作过程繁琐、耗时长，且手工操作带来的人为误差大，不适合大量样品的快速和现场分析。目前，已有商品化的营养盐自动分析仪，如德国的BRAN+LUEBBE AutoAnalyzer 3、荷兰的SKALAR等[3，4]，这些仪器基于气泡间隔连续流动分析（Segmented continous flow analysis， SCFA）技术，自动化程度高，分析速度较快，但仪器价格昂贵。现今，流动注射分析（Flow injection analysis， FIA）技术在海水水质监测中得到了广泛开发和应用，基于FIA原理研发了硝酸盐测定系统[5～7]，这些系统均使用了注入阀（Injection valve）或电磁阀（Solenoid valve）进行试样或试剂的定量，以提高分析的精密度以及重现性。但各种阀的价格较高，且控制程序复杂，不利于普通实验室的推广及应用。如能以某种装置或方式取代阀，一定程度上将降低实验成本，简化控制程序。目前，有研究者利用注射泵定量地将试剂注入样品，同时测定了4种金属元素，但其利用的化学反应只需单一试剂[8]。而对于需用铜镉还原柱还原硝酸盐的测定，单一试剂显然不能满足分析要求。为了注入多种试剂，阀的使用不可缺少[9，10]。

本课题组研发了一种无阀连续流动分析系统[11]，利用连续流动的方式，直接将试剂与样品混合，不需要阀，但会在流路中引入大量气泡； 独特的流通池结构设计可避免流路中气泡对检测信号的影响，已成功应用于亚硝酸盐、磷酸盐和硅酸盐的测定。但对于采用铜镉还原柱还原硝酸盐的测定，进入还原柱的气泡会使得镀在镉表面的铜发生氧化，大大影响硝酸盐的还原效率。本研究对上述原先的系统进行改进，在还原柱的前端增加一个除气泡装置，可有效去除切换样品时产生的气泡，避免气泡进入还原柱。改进后的系统成功用于厦门西港海水样品中硝酸盐的测定以及九龙江河口区的硝酸盐走航式监测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

USB 2000+光纤光谱仪和LS1LL卤钨灯光源（美国Ocean Optics公司）； BT1001L型六通道蠕动泵、内径 0.5 mm和2.0 mm硅橡胶蠕动泵泵管（保定兰格恒流泵有限公司）； 流路管道为内径1.0 mm的聚四氟乙烯管（Polytetrafluoroethylene， PTFE）； 数据采集软件使用Labview 8.2（美国National Instruments公司）编写； 实验室自制流通池（光程1.2 cm）。

实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm， MilliQ Element系统， 美国Millipore公司）。如无特别说明，所用试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。100 mmol/L硝酸盐贮备液：称取1.0100 g经110℃干燥2 h 的KNO3，溶解并定容至100 mL，于4℃保存，标准工作溶液由此贮备液经适当稀释得到。混合显色试剂：2.5 g磺胺（Sulfonamide， SAM）溶于450 mL 5%（V/V）HCl（优级纯）中，加入0.25 g盐酸萘乙二胺（N（1Naphthyl） ethylenediamine dihydrochloride， NED），以5%（V/V）HCl定容至500 mL。人工海水（盐度35）：称取31 g NaCl和10 g Mg2SO4，溶于超纯水中，并稀释至1 L，贮存于聚乙烯瓶中，其它盐度的人工海水由此稀释得到。NH4ClNaOH缓冲溶液（2.5%， m/V）用5 mol/L NaOH溶液调节至pH 8.3。

2.2实验方法

无阀连续流动分析系统的流路如图1所示，主要由两个蠕动泵组成。蠕动泵1将样品以较快流速输送到除气泡装置中，完成一次进样后手动切换至超纯水，进行清洗，切换过程因蠕动泵1持续运转而在管道中引入的气泡在除气泡装置中被除去。除气泡装置中存留的样品溶液由流速较慢的蠕动泵2吸取，多余的樣品经蠕动泵1吸取排出。蠕动泵2吸取的样品溶液与缓冲溶液混合后进入铜镉还原柱，将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 实验中使用的流通池为实验室自行研制[11]， 容积较大，需保证适量试样充满流通池进行检测。但是，若将大量试样直接通过铜镉还原柱，会降低还原柱的使用寿命。考虑到江河及近岸海域的硝酸盐浓度通常较高，对样品进行适当稀释后仍可准确定量，因此，将少量还原后的样品与超纯水混合，稀释后再与混合显色剂混合，进入置于水浴锅中的反应盘管，最后流入流通池测定。

2.3样品采集

厦门西港表层海水样品于2015年12月26日用PVC采样桶采集，装于250 mL聚乙烯瓶并冷藏保存，24 h内测定。

九龍江河口区域的走航式监测，于2016年4月9日在厦门大学“海洋2号”科考船上执行，用船上配备的海水采集设备将表层海水抽至甲板上的自制过滤装置中，经0.45 μm滤膜过滤后与本套装置联用。走航过程中，用100 mL聚乙烯瓶人工采集数个过滤后的样品并冷藏保存，记录采样时间，用于实验室比对分析。

3结果与讨论

3.1实验参数的优化

本装置用蠕动泵作为输液动力，使水样通过铜镉还原柱，将硝酸盐定量还原为亚硝酸盐，然后与显色剂混合。在酸性介质中，亚硝酸盐与显色剂中的SAM进行重氮化反应，其产物再与NED偶合生成红色偶氮染料，于543 nm波长下测定吸光值。通过计算，得到亚硝酸盐氮的总量，扣除水样中原有的亚硝酸盐含量，得到硝酸盐含量。本研究中亚硝酸盐含量由另一通道（不含铜镉还原柱）测定得到。实际环境监测中，硝酸盐含量和亚硝酸盐含量是同时获得的。

在前期研究[11]中，已对亚硝酸盐测定的各参数进行了优化，包括进样时间、显色试剂浓度、反应盘管长度、流速、反应温度等，本实验优化了进样时间和显色试剂浓度。反应盘管长度为2.5 m，反应温度为50℃。考虑到水样过铜镉柱时将产生一定柱压及保证还原效率，流速调整为9.5 mL/min。 优化实验以含20 μmol/L 硝酸盐的纯水加标试样作为测试样，所有样品均测定至少3次，优化结果见图2。

保持SAM浓度为5 g/L，NED浓度为0.5 g/L不变，对样品进样时间进行优化。进样时间依次为5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40和45 s，随着进样时间延长，硝酸盐的信号吸光值增加，并在35 s后峰高基本保持稳定，如图2A所示。综合考虑分析速度和峰形等因素，最佳进样时间选择为35 s，此时样品通过铜镉柱的体积为4.0 mL。保持进样时间为35 s不变，考察显色试剂浓度对硝酸盐的信号吸光值的影响。随着试剂浓度增加，信号吸光值增加，当试剂浓度达到一定量时，吸光值基本稳定。最终选择显色试剂浓度分别为： 5 g/L SAM， 0.5 g/L NED（图2B和2C）。

3.3盐度的影响

样品的盐度越大则离子强度越高，而高离子强度会影响化学反应速率，从而影响方法灵敏度。为了考察盐度对本方法的影响，取盐度为35的人工海水，用超纯水稀释后得到盐度分别为0， 7， 14， 21， 28和35的人工海水。以这些不同盐度的人工海水作为基底，分别配制工作曲线溶液，绘制相应的工作曲线。6条工作曲线线性相关系数R2在0.9979～0.9995之间，斜率的RSD在±2.5%之内，表明盐度对本方法的影响可以忽略的，本方法适用于河口及近岸盐度变化大的区域，也可用于江、河、湖等地表水中硝酸盐的分析。

3.4记忆效应的影响

在流动分析系统中，高浓度样品的显色产物若清洗不完全，可能会对下一个样品的测定产生影响，故记忆效应值得关注。参照文献[13]的方法，考察了记忆效应对本方法的影响。取80 μmol/L硝酸盐为高浓度试样，连续测定3次，平均吸光值为0.4881±0.0031（RSD=0.6%）； 随后，取10 μmol/L硝酸盐为低浓度试样，连续测定4次，平均吸光值为0.0538±0.0002（RSD=0.7%）； 再次测定高浓度试样，平均吸光值为0.4879±0.0049（RSD=1.0%）； 最后测定低浓度试样，平均吸光值为0.0531±0.0005（RSD=1.6%）。实验结果表明，80 μmol/L硝酸盐前后多次测定的吸光值为0.4880±0.0036（RSD=0.8%），10 μmol/L硝酸盐前后多次测定的吸光值为0.0534±0.0007（RSD=1.3%）。可见，高浓度试样基本不会对下一个较低浓度试样的测定产生影响，记忆效应可以忽略。

3.5方法的验证与比对

用本方法测定各种实际水样中的硝酸盐，并进行基底加标，考察基底加标回收率，结果见表1。 加标回收率在99.4%±3.4%～106.1%±0.2%之间，说明本方法适合用于不同基底样品的分析，再次证明方法的广泛适用性。

3.6方法的应用

用本方法测定采自厦门西港的表层海水样品，测定结果见表2。调查海域的表层海水中，高潮时硝酸盐浓度在59.84～103.2 μmol/L之间，低潮时硝酸盐浓度在86.74～177.3 μmol/L之间，低潮时受九龙江水带来的陆源营养盐的影响，硝酸盐的浓度较高。

2016年4月9日，应用本方法与本课题组前期研发的其它营养盐测定方法[11]，对九龙江河口及厦门近岸海域中的硝酸盐进行了走航式监测。走航中同时采集数个水样，带回实验室进行比对测试。

此次走航式监测同时获得了硝酸盐、亚硝酸盐、活性磷酸盐、活性硅酸盐的高分辨率浓度数据，见图5。监测数据表明，各营养盐浓度与盐度具有良好的相关性，且各营养盐浓度的变化规律也较为一致。实验室分析人工采集的样品，得到的数据与现场测定值基本吻合，结果见图5。

4结 论

建立了无阀连续分析海水中硝酸盐的方法，简单、快速、实用，且不受海水盐度的影响。在优化条件下，本方法检出限为0.27 μmol/L，平行性良好，与流动注射法相比，测定结果无显著性差异，但成本更低，操作更简便。

本方法已成功用于离散样品测定以及走航式在线连续监测，证明其实用性强，可在普通实验室推广使用，有望发展成为现场监测仪器。

AbstractA valvefree continuous flow method and instrument were established， with only a multichannel pump for delivering the sample and reagent， and without any injection or solenoid valves and sample loop for selecting and adding the sample or reagent. Nitrate was reduced to nitrite with CuCd reductant column， and then detected with spectrophotometric detector. The proposed method was suitable for determination of nitrate at normal level in most of estuary and coastal seawaters. With the optimum parameters， the linear range and detection limit were 5-180 μmol/L and 0.27 μmol/L， respectively. The samples of 10 and 80 μmol/L nitrate were continually measured for 11 times， and the relative standard deviations were 1.4% and 1.3%， respectively. The recovery of real samples at different salinity ranged between 99.4% and 106.1%. There was no significant difference in the analytical results between the proposed method and the flow injection analysis （FIA）. In comparison with FIA， the method and instrument were less cost and easy to operate， and was suitable to be applied in general laboratories and field for continuous monitoring. The method was successfully used to measure the nitrate in seawater samples in Xiamen's Western Harbor and monitor nitrate in Jiulongjiang estuary.

KeywordsValvefree； Continuous flow analysis； Seawater； Nitrate