CD3+HLA-DR细胞与POI患者免疫紊乱及卵巢功能的关系

2020-05-23郭蜜甜张继王素梅

分子诊断与治疗杂志 2020年3期

郭蜜甜张继王素梅

早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）多发生于女性40岁之前，发生率约为1.0%～2.0%[1]，主要表现为血清促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、雌二醇（Estradiol 2，E2）水平上升，雌激素水平下降，会引发卵巢功能衰竭，诱导闭经提前[2]。目前临床尚未完全明确POI 发病机制，相关研究发现，POI患者与自身免疫紊乱存在密切联系，最终会引发卵泡缺失，或诱发卵泡对FSH 反应低下，降低卵巢功能[3]。同时，相关研究还显示，POI患者外周血中存在细胞免疫、体液免疫改变现象[4]。另外，有学者指出，人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）主要表达于多种淋巴细胞上，在免疫反应中具有关键作用[5]。然而关于CD3+HLA-DR细胞与POI患者细胞免疫、体液免疫、卵巢储备功能关联性研究鲜有报道。本研究旨在探讨CD3+HLA-DR细胞与POI患者免疫紊乱、卵巢功能的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取本院2018年1月至2019年9月POI患者136例作为观察组，另选取同期健康育龄女性130例作为对照组。本研究均经本院医学伦理委员会审批同意。

纳入标准：①观察组符合《2016 ESHRE 指南：女性过早卵巢功能不全的管理》中POI 诊断标准[6]，并经阴道超声检查确诊；年龄＜40岁；月经稀发或停经时间≥4个月；均伴有月经改变、生育力低减等临床症状；FSH 水平＞40 U/L，E2 水平＞183 pmol/L；②对照组月经正常，未合并其他妇科炎症；③两组临床资料均完整，且患者及家属均签署知情同意书。排除标准：①卵巢抵抗综合征、多囊卵巢综合征、卵巢不敏感综合征、功能性下丘脑性闭经或完全性雄激素不敏感综合征者；②合并甲状腺功能亢进或减退者；③生殖道发育异常者；④妊娠或哺乳期女性；⑤卵巢手术或化疗所致卵巢衰竭者；⑥盆腔占位性病变或盆腔炎症者；⑦近4 周内有免疫抑制剂、激素或抗肿瘤药物服用史者；⑧精神行为异常者。

根据住院相关文献、病历资料等，设计临床研究表（CRF），主要调查年龄、初潮年龄、体质量指数、停经时间、产妇类型等内容。

1.2 方法

空腹取8mL 静脉血：①离心分离外周血淋巴细胞，采用PE-conjugated Anti-HLA-DR、FITC-anti-CD3 的同型单克隆抗体进行孵育，应用流式细胞仪检测CD3+HLA-DR 抗原淋巴细胞的表达水平，仪器购自美国BD 公司；②应用流式细胞仪检测CD3+、CD8+、CD4+水平；③离心12 min，3 000 rpm，取血清，采用免疫比浊法检测免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、IgM、IgG（上海瑞番生物科技有限公司）；采用酶联免疫吸附试验检测血清抗苗勒氏管激素（Anti-mullerian hormone，AMH）（上海雅吉生物科技有限公司），上述均严格按照仪器、试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件分析处理数据，计数资料用n（%）表示，行χ2检验；计量资料采用（）表示，两组间用t检验，采用Pearson 进行相关性分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

两组年龄、初潮年龄、体质量指数、停经时间、产妇类型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较（±s）Table1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

一般资料年龄（岁）初潮年龄（岁）体质量指数（kg/m2）停经时间（个月）孕次（次）产妇类型初产妇经产妇观察组（n=136）32.74±2.59 13.48±0.22 22.89±1.64 7.92±1.15 1.98±0.40 79（58.09）57（41.91）对照组（n=130）33.05±2.17 13.50±0.20 23.11±1.49 8.01±1.29 2.00±0.39 75（57.69）55（42.31）t/χ2值1.056 0.775 1.144 0.601 0.413 0.004 P 值0.292 0.439 0.254 0.548 0.680 0.948

2.2 两组外周血CD3+HLA-DR细胞

观察组外周血CD3+HLA-DR细胞比例（13.52±2.49）%，对照组外周血CD3+HLA-DR细胞比例（8.77±1.63）%。两组比较，观察组外周血CD3+HLA-DR细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（t=18.319，P＜0.001）。

2.3 两组免疫指标

观察组血清IgA、IgM、IgG 水平低于对照组，CD3+、CD8+水平高于对照组、CD4+低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组免疫指标比较（±s）Table2 Comparison of immune indexes between the 2 groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 136 130体液免疫指标（g/L）IgA 1.34±0.26 1.83±0.37 12.541＜0.001 IgM 1.55±0.32 2.06±0.40 11.508＜0.001 IgG 8.69±1.61 12.42±2.08 16.397＜0.001细胞免疫指标（%）CD3+72.84±5.01 68.03±4.12 8.531＜0.001 CD8+34.82±4.77 26.11±3.96 16.165＜0.001 CD4+32.43±3.20 38.72±4.55 13.088＜0.001

2.4 外周血CD3+HLA-DR细胞与体液免疫、细胞免疫相关性

外周血CD3+HLA-DR细胞与CD4+、血清IgA、IgM、IgG 呈负相关，与CD3+、CD8+呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1～2。

2.5 两组卵巢储备功能

观察组血清AMH、AFC、子宫内膜厚度低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

图1 外周血CD3+HLA-DR细胞与体液免疫相关性Figure1 correlation between peripheral blood CD3+HLA-DR cells and humoral immunity

图2 外周血CD3+HLA-DR细胞与细胞免疫相关性Figure2 correlation between peripheral blood CD3+HLA-DR cells and cellular immunity

表3 两组卵巢储备功能比较（±s）Table3 Comparison of ovarian reserve function between the 2 groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 136 130血清AMH（ng/mL）1.15±0.04 5.27±1.80 26.688＜0.001 AFC（个）1.28±0.64 5.65±2.19 22.298＜0.001子宫内膜厚度（mm）3.82±0.63 6.47±1.56 18.311＜0.001

2.6 外周血CD3+HLA-DR细胞与卵巢储备功能关联性

外周血CD3+HLA-DR细胞与血清AMH、AFC、子宫内膜厚度呈负相关（P＜0.05），见图3。

3 讨论

相关文献报道，组织中HLA-DR 抗原表达异常，会诱导抗原呈递细胞将自身抗原递呈至辅助T细胞，从而启动、延续自身免疫反应[7]。宗国霞等[8]通过对比63例POI患者、40例健康育龄女性，结果表明，外周血CD3+HLA-DR细胞水平在POI患者呈明显异常高表达，与本研究观点一致，提示外周血CD3+HLA-DR细胞水平可能参与POI 发生、发展。HLA-DR 作为MHCⅡ分子，具有抗原呈递作用，一定程度会激活自身免疫应答，诱导B 细胞形成自身抗体，从而对卵泡产生攻击、破坏，增加卵巢早衰发生率。同时，本研究采用流式细胞仪检测还发现，POI患者CD4+、血清IgA、IgM、IgG水平明显低于健康育龄女性、CD3+、CD8+水平高于健康育龄女性，与谢树红[9]结果相似，有力佐证了POI患者机体存在T细胞介导的免疫损伤表现。T细胞亚群中辅助细胞、杀伤抑制细胞紊乱，会分化制造IgA 等免疫球蛋白，攻击颗粒细胞等卵巢靶细胞，引发卵泡过度闭锁，诱导卵巢细胞凋亡，增加排卵障碍发生危险性，从而迅速降低卵泡数量，提高POI 发生风险[10-11]。经Pearson 相关性进一步证明，外周血CD3+HLA-DR细胞与CD4+、血清IgA、IgM、IgG 存在负相关关系，与CD3+、CD8+存在正相关关系，充分说明CD3+HLA-DR细胞能有效反映POI患者机体细胞免疫紊乱状态，原因考虑与CD3+HLA-DR细胞能激活POI患者机体辅助性T细胞，识别自身抗原，诱发自身免疫反应有关。

周灿权等[12]认为，卵泡过早衰竭的主要原因为卵巢内卵泡数目降低，闭锁卵泡数目上升。AMH 在卵泡障碍性疾病发生中起着关键作用，能阻碍原始卵泡初始募集，减少原始卵泡耗损，减轻生长卵泡对FSH 刺激的反应性，干扰卵泡选择。同时，国外研究认为，AMH 水平下降及其在特定时期迅速减少是卵巢储备功能低下的重要标志[13]。AFC 是卵巢储备功能的标志物，李曼等[14]观点表明，AFC 异常表达一定程度能反映卵泡成熟度。另外，采用阴道超声检查子宫内膜厚度有助于监测卵泡发育程度，为评估卵巢储备功能提供数据支持。本研究发现，POI患者血清AMH、AFC、子宫内膜厚度均低于健康育龄女性，提示POI患者存在卵巢储备功能下降现象。T细胞调节介导的自身免疫反应是POI 的病理基础，而T细胞活化可能会加快对卵巢颗粒细胞的免疫应答，进而加重卵巢颗粒细胞损伤[15]，减少血清AMH、AFC，降低子宫内膜厚度，损伤卵巢储备功能。进一步研究外周血CD3+HLA-DR细胞与POI患者卵巢储备功能关联性显示，外周血CD3+HLA-DR细胞与血清AMH、AFC、子宫内膜厚度存在明显负相关关系，CD3+HLA-DR细胞可能通过与浸润淋巴细胞相互作用，促进黄体溶解，调控POI患者FSH、E2 等性激素水平，影响卵巢存储功能，可见外周血CD3+HLA-DR细胞有望成为调节POI患者卵巢储备功能的重要T细胞亚群。