肿瘤微环境中外泌体在肿瘤发生发展中作用及机制

杨硕 杨清玲 陈昌杰

外泌体（exosome）是一种直径在30～100 nm 的双层膜性囊泡[1]，可由多种细胞通过胞吐方式分泌至微环境中。1983年，Johnstone 等[2]从羊网织红细胞上清液中分离出一种小囊泡，最初被认为是细胞分泌的垃圾，后随着对外泌体研究的深入，发现这些囊泡富含很多成分，如细胞特异性的蛋白质、脂质、RNA（mRNA、miRNA 及其他非编码RNA）[3]。外泌体可由多种细胞如肿瘤细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等分泌，广泛分布于血液、尿液、腹腔积液、滑膜液、乳汁等各种体液中[4]，通过携带和传递重要的信号分子作用于靶细胞中从而影响目标细胞的生理与病理状态。研究证明外泌体参与细胞间通讯、免疫反应、血管形成和肿瘤细胞生长[5]。目前在多种类型的细胞中均发现了外泌体，而肿瘤细胞来源的外泌体由于它本身的特性和功能特点逐渐成为肿瘤方向的研究热点。外泌体可释放自身携带的细胞因子等促进肿瘤的发生、发展、增殖与迁移，使肿瘤产生耐药性，给肿瘤的治疗带来不利影响。本综述回顾近年来肿瘤微环境中外泌体的研究成果，旨在阐述肿瘤来源的外泌体在肿瘤微环境中的产生机制从而为临床诊断治疗肿瘤提供新的方向。

1 外泌体的产生、组成和主要生物学功能

外泌体的形成主要经出芽、内陷、多泡体形成及分泌四个过程。外泌体产生于细胞内体。源于细胞质膜内陷形成早期内体，晚期内体向内出芽形成管腔状囊泡，转变成含多个小囊泡的多泡体（multivesicular body，MVB），而后MVBs与胞膜融合后其内囊泡再次凹陷，以内出芽的方式形成颗粒状小囊泡，并释放到细胞外，即为外泌体。外泌体到达受体细胞后通过与配体结合、吞噬和与质膜融合的方式在特定细胞内释放内容物，从而改变细胞生理状态和功能[6]。

外泌体主要由蛋白质、核酸和脂质构成。所有的外泌体有共同的蛋白质如CD9、CD63、CD81、CD82 等，这些可作为生物标记物，还可能与外泌体的生物来源有关。不同细胞来源的外泌体表达特异性蛋白，如肿瘤易感基因101 蛋白（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALix）、热休克蛋白HSP70 等与细胞的特定功能相关[7]。外泌体还含有大量的核酸，如mRNA、miRNA和lncRNA 等。这些核酸与靶细胞融合作用于受体细胞，可调节受体细胞的蛋白表达和信号通路[8]。外泌体含有的脂质包括胆固醇、甘油二脂和磷脂等[9]。不仅参与形成和维持外泌体的形态，还可作为信号分子参与细胞间的信息通讯过程。这些内容物随着体液运输至目标细胞并被摄取参与血管形成及肿瘤的发生、发展和转移。

现今外泌体是细胞间通讯、免疫调节、疾病诊断和预后标志物的重要载体。肿瘤来源的外泌体通过TGF-β和IL-10 促进Treg 增殖，从而增加它们对细胞凋亡的抗性[10]。为外泌体的免疫调控作用提供了新的探索方向。此外Nilsson-l 等[11]的研究发现活化的NK 细胞受体NKG2D 的配体视黄酸转录本-1/UL16 结合蛋白（RAET1/ULBP）1-6 在外泌体膜表面捕获NKG2D，降低NKG2D 的表达，使其不能激活NK 细胞、自然杀伤T细胞，进而引起免疫逃逸。因此减少NKG2D 的配体能够实现良好的抗肿瘤免疫治疗效果。另外Kordelas 等[12]研究发现，干细胞外泌体可降低抗移植物抗宿主病（therapyrefractory graft-versus-host disease，GVHD）患者体内的IL-1β、TNF-α 及γ-干扰素水平，调节机体免疫，促进受损组织修复。近年来外泌体领域的研究已经成为未来应用研究的新方向。

2 外泌体在肿瘤微环境中的作用

2.1 改变肿瘤转移前微环境

肿瘤微环境主要是由肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞和细胞外基质共同构成的，是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，微环境的成分与肿瘤细胞之间相互作用，从而促进肿瘤的发生、发展和转移。不同来源的外泌体可通过改变微环境影响受体细胞。Gu 等[13]研究发现，胃癌细胞来源的外泌体具有诱导分化的能力，能转运转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），后与间充质干细胞表面的受体相互作用，进一步激活TGF-β/Smad 通路，使间质干细胞向肿瘤细胞相关成纤维细胞分化，参与肿瘤微环境的形成，从而有利于肿瘤的生长与转移。Grange 等[14]发现CD105+肾细胞瘤分泌的外泌体可以激活内皮细胞，使其在基底膜基质组建毛细管样结构，并且诱导化疗耐药性的产生；此外，这个实验还表明，通过上调MMP2、MMP9和VEGFR1，SCID 小鼠分泌的CD105+外泌体有助于肿瘤在肺组织中构建转移微环境。另有研究发现小鼠黑色素瘤来源的外泌体可提高肺内皮细胞的渗透性，促进肺转移；此外，黑色素瘤来源的外泌体能聚集骨转移来源的外泌体，形成转移微环境[15]。

2.2 外泌体参与血管形成

肿瘤血管形成的过程包括内皮细胞移行、增殖和形成新的基底膜。研究发现[16]多种活性物质可调节肿瘤血管生成，这些促进新血管生成的血管生成因子主要是细胞因子类的多肽物质如血管内皮生长因子（Vadcular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF）、脂类及维生素等。肿瘤的血管形成为肿瘤细胞的生长、侵袭与转移提供了良好的环境，在肿瘤进展中占据了重要的作用。目前研究发现[17]外泌体通过不同途径参与肿瘤血管的形成。如黑色素瘤细胞分泌含有IL6、VEGF和MMP2 等物质的外泌体，可通过激活WNT5A 信号通路促进肿瘤血管的生成。另外，慢性髓源白血病来源的外泌体miR92a，可与内皮细胞上的整合素α5 相互作用，引起血管内皮细胞迁移和原始血管管腔形成，从而促进肿瘤血管的生成，为肿瘤细胞的侵袭和转移发挥重要作用[18]。Hsu YL等[19]研究发现肺癌细胞分泌的外泌体miR-23a 直接抑制脯氨酰羟化酶1和2（prolyl hydroxylas，PHD1和2）的表达，导致内皮细胞中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的积累。此外，外泌体miR-23a 还抑制紧密连接蛋白ZO-1，从而增加血管通透性和肿瘤细胞的跨内皮迁移能力。由此可得，肿瘤来源的外泌体介导不同信号分子参与肿瘤血管的形成和改变血管通透性，从而促进肿瘤的发生、发展与转移。

2.3 外泌体在肿瘤转移中的作用

外泌体促进肿瘤转移表现在外泌体可直接促进肿瘤的侵袭和转移。因外泌体内容物蛋白质、脂质、RNA 作用于受体细胞，使得钙离子减少，削弱了细胞间的粘附作用，促进肿瘤的迁移和侵袭[20]。另外肿瘤细胞通过外泌体与肿瘤微环境中的细胞外基质细胞相互作用，促进肿瘤的侵袭。例如肿瘤微环境中脂肪细胞来源的间充质细胞可转化为成纤维细胞的外泌体可与肿瘤细胞分泌的SMAD 信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移[21]。Jan 等[22]研究显示外泌体促癌作用存在于老鼠肿瘤4T1 细胞中，其4T1 细胞外泌体在4T1+CD11 比4T1-CD11 明显增加，肿瘤分泌的外泌体能改变微环境的状态从而影响肿瘤相关巨噬细胞浸润和M2 极化导致肿瘤的生长。Yang[23]等发现活化的巨噬细胞通过外泌体传递有侵袭能力的miR-223，并进一步通过Mef2c-β-catenin 信号通路促进肿瘤细胞的侵袭，在卵巢癌中发现，癌旁成纤维细胞中LINC00092 显著升高，同时趋化因子CXCL14 的升高，与卵巢癌的转移与不良预后有显著关系[24]。转移的肿瘤细胞在出发前会先行释放出外泌体，外泌体会到达预期转移的器官，被相应的细胞所摄取，改变这些靶细胞的状态，营造一个适合转移来的肿瘤生长的微环境。在这其中，外泌体表面的整合素种类决定靶器官的特异性，例如整合素α6β4和α6β1与肺转移有关，而整合素ανβ5与肝转移有关[25]。

2.4 外泌体影响免疫系统的调节

肿瘤微环境中的免疫细胞在肿瘤的发生进展中发挥着重要作用，肿瘤来源的外泌体对免疫系统具有抑制作用，有利于肿瘤细胞的逃逸，进而促使肿瘤细胞的侵袭与转移。有研究发现[26]肿瘤来源的外泌体含有miR-21和miR-29a，两者均与免疫细胞表面细胞内toll 样受体（TLR）结合，从而触发促转移炎性反应。在NK 细胞中可下调NKG2D 的表达，导致受体脱敏和内化，降低NK 细胞活性。外泌体含有的EGFR 可能诱导致耐受性树突状细胞和调节性T细胞，最终导致肿瘤抗原特异性CD8+T细胞受抑制。黑色素瘤和结直肠癌来源的外泌体促进CD14+单核细胞分化为MDSC，外泌体与单核细胞相互作用，分化为树突状细胞，并促进维持不成熟的单核细胞状态。这些细胞自发地分泌免疫抑制性细胞因子，如TGF-β和前列腺素E2 从而抑制T细胞的增殖[27]。Wang 等[28]的研究证实，巨噬细胞分泌的外泌体包含的mirco155 传递给心脏成纤维细胞，抑制心脏成纤维细胞增殖并促进心脏局部的炎症发生。从以上结果表明，肿瘤来源的外泌体能够在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用，促进肿瘤的发展。

3 外泌体在肿瘤临床诊断与治疗中的作用

3.1 外泌体在临床诊断中的作用

肿瘤患者由于发现较晚常常治疗效果不是很显著，因此寻找一种既特异性强又无毒性的肿瘤标志物越来迫切。最近几年研究发现外泌体有望成为新的肿瘤标志物，因为外泌体广泛分布于真核细胞中，不同类型肿瘤细胞分泌的外泌体里的内容物不同对于诊断不同肿瘤提供帮助。不同肿瘤细胞来源的外泌体携带特异性的蛋白质和核酸分子等物质，因此可通过检测外泌体内特异性的蛋白与核酸来检测相应疾病的诊断。外泌体在不同类型肿瘤中如肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌的体液中检测到，具有易取材，重复取材的特点，可以在-70℃的条件下长期保存[29]。此外外泌体的双层膜结构能有效保护内容物蛋白质和核酸被体内的酶所降解，有利于作为生物标志物被检测出。于乐成[30]等研究发现，外泌体中的miR-92a 在肝细胞癌中过度表达，可能作为原发性肝癌的诊断标志物用于临床检测。Brase 等[31]研究发现，miRNA-375和miRNA-141 在前列腺患者血液外泌体中的表达增强，可作为诊断标志物用于前列腺癌的早期筛查。另一项研究表明[32]，血浆外泌体中生存素在肿瘤患者中明显增加，并与患者临床分期呈负相关。生存素survivin 在甲状腺癌中具有重要的诊断、预后价值。这表明通过检测外泌体中生存素表达水平，即可有效诊断甲状癌、评估甲状腺癌患者病情。从以上可得知，不同肿瘤细胞来源的外泌体携带的蛋白质跟核酸分子可作为肿瘤标志物可提高对肿瘤诊断的准确性。

由此可见，对外泌体的研究会越来越深入，外泌体在细胞间通讯、肿瘤生长、免疫调节等作用会进一步地被揭开。因外泌体内含多种蛋白质、脂质和核酸，广泛分布于不同体液中，伤害小，因此可成为肿瘤诊断的新的肿瘤标志物，提高肿瘤早期诊断的机率。外泌体也是肿瘤微环境的重要组成部分，参与了肿瘤发生发展侵袭等多种过程，外泌体在微环境中的具体作用还需进一步的探索。随着精准医学时代的到来，人们会更加注重研究外泌体与肿瘤之间的密切关系，以此提高肿瘤诊断率。

3.2 外泌体在临床治疗中的作用

肿瘤细胞来源的外泌体能改变肿瘤微环境，促进肿瘤的转移。因此，减少肿瘤细胞外泌体的分泌是治疗肿瘤的一个有效措施。鉴于外泌体安全性高、特异性强、易于取材的特性，越来越成为目前研究的热点，目前肿瘤的治疗方法主要有化疗、放疗、生物靶向治疗和手术治疗。但是这些治疗方法受到对肿瘤耐药的影响，再加上肿瘤极易复发和转移，因此给治疗肿瘤带来了挑战，为此需要开发一种提高对肿瘤细胞耐药敏感性且无毒性的新型治疗方式。外泌体可作为运输抗肿瘤药物的载体将内容物如蛋白质、核酸等释放到肿瘤细胞中调节受体细胞的基因及影响肿瘤微环境的变化，从而达到抗肿瘤的作用[33]。肿瘤分泌的外泌体可作为运输载体将紫杉醇等化疗药物运输到肿瘤细胞内以达到抗肿瘤的作用[34]。另有研究发现，肿瘤组织的循环肿瘤细胞的人类表皮生长因子-2（HER-2）阴性的患者在治疗中检测到循环肿瘤细胞的HER-2 可转变为阳性，患者服用贝伐单抗药物后获得较好疗效[35]。另外Ichim 等[36]研究发现表明，外泌体切除能够降低外泌体对免疫系统的逃逸，从而增加免疫治疗的敏感性。因外泌体表面携带特异性蛋白、整合素与分子伴侣等，已被应用在纳米药物作为抗肿瘤的疫苗作为临床治疗癌症的方案。

4 展望与总结

肿瘤细胞来源的外泌体释放到细胞外通过体液循环与靶细胞上的受体结合，转运特征性蛋白质和核酸，在促进肿瘤的侵袭和转移的过程中发挥着重要作用。因此明确外泌体的功能对于了解其在肿瘤微环境中的作用起着重要作用，随着对外泌体的深入研究，使我们对肿瘤细胞间的相互交流与机制有了深刻理解，为诊断与治疗肿瘤提供了新的理论依据。长期以来，对外泌体的研究主要集中在研制特定靶向的抗肿瘤疫苗，该疫苗是增强免疫还是耐受，其内在机制仍需探讨。因外泌体广泛分布于体液中，且有较长半衰期，可能成为适合的药物载体。但是目前对于外泌体作为药物载体的可行性有待研究。总之，随着对外泌体认识的加深，以外泌体研究为基础明确肿瘤检测、诊断、治疗方法，有望开发新的抗肿瘤药物及临床肿瘤干预措施。