新型冠状病毒实验室诊断技术进展

席婧媛 于广鑫 钱相君 鲁凤民，2★

冠状病毒曾在人间引起多次流行，其中最为严重的就是21世纪初暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）感染[1]。新型冠状病毒（SARSCoV-2）是迄今为止被发现的第7种可感染人的冠状病毒。生物信息学及形态学分析表明，SARSCoV-2 属于β-冠状病毒，具有冠状病毒的典型特征，全基因组序列分析显示，该病毒与蝙蝠携带的SARS 样冠状病毒RaTG13 株亲缘关系最近，同源性达到96%；近日有研究发现，SARS-CoV-2 已经演化出L和S 两个亚型，二者之间在传播和致病能力上可能存在较大区别[2-4]。SARS-CoV-2 在人间传染性极强，且发病后存在发展为重症、甚至死亡的可能。因此，对感染者早发现、早隔离、早治疗十分关键。

1 诊断方案变迁及仍存在的问题

1.1 诊断标准

随着对新型冠状病毒肺炎（Corona virus Disease 2019，COVID-19）认识的不断加深，新型冠状病毒肺炎诊疗方案（简称诊疗方案）及其中的诊断标准也在不断进行着更新和完善。在诊疗方案（第一版）中，疑似病例主要根据患者的流行病学史和临床表现进行判断，并主要依靠对其标本的病毒全基因组测序进行确诊。随着核酸检测试剂盒的面世，在随后的诊疗方案（第二版）至诊疗方案（第六版）中，疑似病例的病原学检查确诊标准更新为：实时荧光RT-PCR检测病毒核酸阳性或病毒基因测序结果与已知的新型冠状病毒高度同源；而最新的诊疗方案（第七版）则在前版的基础上增加了对疑似病例血清学检查确诊的选项：血清新型冠状病毒特异性IgM 抗体和IgG 抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG 抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。值得一提的是，在诊疗方案（第五版）及其修订版中对于湖北省内还特别增加了“临床诊断病例”，该诊断主要基于疑似病例合并肺炎影像学特征做出，这一改变在短期内使当地大量待收治的患者得到了诊断和及时收治；但对“确诊病例”的诊断，不论是对湖北省内还是省外，仍规定应进行相关的病原学检测方能确诊。在诊疗方案（第六版）和诊疗方案（第七版）中，对湖北省内外的诊断标准已无区别[5]。

确诊标准中另一个主要变化是病毒检测标本的取样方式和位置。诊疗方案（第一版）规定采集痰液、咽拭子等呼吸道标本；在第二至第三版中增加了下呼吸道分泌物；第四至第五版中在增加了血液和粪便标本后，又特别强调了呼吸道和血液标本的检测；在最新的第六和第七版中则指出检测下呼吸道标本（痰或气道抽取物）更加准确。这些变化提示，随着对SARS-CoV-2 及其所引起肺炎的临床和基础研究不断加深，诊疗方案仍有必要根据形势及时进行更新与修订。

1.2 疑似病例的排除和出院标准

目前最新的诊疗方案（第七版）对疑似病例的排除做出了规定：疑似病例连续两次SARS-CoV-2核酸检测阴性（采样时间至少间隔24 小时）且发病7天后SARS-CoV-2 特异性抗体IgM和IgG 仍为阴性可排除疑似病例诊断。在患者出院标准的规定中，除了要求体温恢复正常3天以上、呼吸道症状明显好转和肺部影像学显示急性渗出性病变明显改善外，还要求连续两次痰、鼻咽拭子等呼吸道标本核酸检测阴性，且规定采样间隔时间至少24 小时[5]。然而，最近徐海波等[6]在其研究中发现有4例已经符合出院或解除隔离标准的COVID-19 患者在5 至13天后RT-PCR 复检结果却为阳性。这进一步引起了人们对少部分康复患者是否仍可能是病毒携带者和潜在传染源的担忧。随着临床治愈患者的不断增加，思考并尝试回答这一问题尤为重要。

2 核酸检测

新型冠状病毒作为一种新出现的病原体，很难用病毒分离培养方法在较短时间进行临床检测。因此，基于病毒基因组测序和实时荧光定量RT-PCR 法等的核酸检测技术成为最早用于确诊新型冠状病毒感染的病原学手段。

2.1 病毒基因组测序

基因组测序以其在新发病原体检测方面的优势，在疫情早期病原学诊断及病毒基因组序列的鉴定上做出了巨大贡献。疫情爆发之初，我国科研团队最早在5天内就完成了对新型冠状病毒基因组的鉴定分析，并公开了基因组序列[7-9]，为接下来的临床筛查、诊断和治疗赢得了宝贵的时间。

2.2 基于扩增技术的病毒核酸检测

随着新型冠状病毒基因组序列的公布，国内外多个团队迅速据此设计出了基于RT-PCR 技术的检测方法，这些技术多采用TaqMan 探针法，其引物探针设计主要集中在ORF1ab、E 基因和N 基因[10，11]。这为及时发现感染者并进行隔离治疗提供了可靠的实验室手段，为疫情控制提供了依靠。与常规PCR 技术相比，恒温扩增技术的优势在于整个反应可在一个温度下完成，规避了频繁的升降温过程，使检测耗时更短、操作安全性增加，更适合不具备PCR 实验设备及条件的基层医疗机构用于开展病毒检测和诊断。目前，国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）已经应急批准了10个可用于临床检测的新型冠状病毒核酸检测试剂，有效缓解了实验室诊断能力不足的问题。

2.3 CRISPR 技术

除了上述检测方法之外，张峰团队[12]研制了一种基于CRISPR 技术检测新型冠状病毒RNA的方法，并将其开发成了一种即时检验（point-of-care testing，POCT）产品，其特点在于不依赖复杂仪器，一小时内即可在试纸条上呈现检测结果。目前该方法尚处于验证阶段，还不能直接应用于临床。

2.4 局限性

病毒核酸假阴性是基于扩增技术的检测方法在临床应用中遇到的最大挑战。即使是在确诊病例中，SARS-CoV-2 核酸检测阳性率也仅有30%～50%。从病程角度考虑，患者从感染到症状出现，潜伏期平均为5.2天[13]，因此在感染极早期阶段，患者样本中病毒载量低于试剂检测下限是有可能的，此时需要连续数次采集标本进行检测才能降低假阴性率。此外，近日公布的对新型冠状病毒感染患者的微创组织活检和尸体解剖结果均显示，SARS-CoV-2 主要感染部位在人体下呼吸道及肺部[14-15]。但采集肺泡灌洗液由于操作复杂、操作者的暴露风险大，临床应用受限。尽管指南强调留取痰液对提高检出率的重要性，然而部分病患仅有干咳或无咳嗽症状，痰液采集较为困难，因此临床仍以上呼吸道的鼻咽拭子采集为主，而鼻咽拭子采集随机性较高，受采样技术影响较大。一项对18例患者的72个鼻咽拭子的检测结果分析提示，在上呼吸道样本中鼻拭子的病毒载量高于咽拭子[16]。可见，采样部位的复杂性以及采样不精准是造成假阴性的重要原因之一。据Yang等[17]报道，有些患者在出现症状后约5～6 d，咽拭子和痰液样本中的病毒载量达到峰值，而另有部分患者在住院期间，痰液样本中病毒载量会发生波动，结合部分患者达到出院标准后核酸复检阳性这一事实，推测SARS-CoV-2 很可能有间歇性排毒现象，这对于病毒核酸的检测十分不利，如能在当前政策的基础上，适当严格疑似病例的排除和出院标准，例如增加采样部位或检测次数，将有利于控制疫情传播[6]。考虑到SARS-CoV-2 是RNA病毒，多数医院由于条件受限，需要将样本运送到当地疾病预防与控制中心或第三方实验室进行检测，而运输过程中的降解可能是造成假阴性的另一个原因。另外，就试剂质量而言，早期的引物设计参考序列有限，加上应急审批流程，不少试剂并未得到足够数量的临床标本进行验证[18]。而且，往往只有在出现症状5天内从咽拭子中分离出的病毒才具有复制活性[19]。因此，感染后不同时间、不同部位病毒核酸检出的实际临床意义仍有待进一步研究。

引物和探针选取靶点的不同会影响扩增效率和检测灵敏度，进而影响弱阳性样本的检出。因此有必要通过全国协作获得尽可能多时间和地理上无关的SARS-CoV-2 临床分离株，通过二代测序分析，进一步评估病毒突变的程度，提高对病毒变异规律的认识，以促进更为保守序列的确定和兼容引物、探针的设计，实现检测试剂的更新换代。同时，大力研发高敏核酸检测试剂，及早发现处于低病毒潜伏期的感染者，将有利于疫情控制。

3 抗-SARS-CoV-2 特异性抗体检测

机体发生感染性疾病后也可通过抗体检测进行快速诊断，检测的靶标主要是针对不同病原体产生的特异性抗体。IgM 被认为是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，通过检测病毒特异性IgM可早期诊断病毒感染；IgG 在血清中略晚于IgM 出现，但其对病毒感染仍具有辅助诊断价值，而且，因在血清中维持时间较长，IgG 还可应用于流行病学调查[20]。目前临床上常用于抗体检测的方法主要有免疫胶体金技术和酶联免疫吸附测定。

3.1 免疫胶体金技术

免疫胶体金诊断技术起源于上世纪80年代，它是一种以胶体金为标记物，在免疫分析中对样本中蛋白等生物大分子进行定性检测的免疫学技术。最近，多家单位共同研发出了SARS-CoV-2 IgM和IgG 抗体胶体金检测试剂盒，并以核酸检测结果作为参考，对已知样本进行了检测。结果发现，以核酸检测阳性人群为阳性对照，健康人群为阴性对照，IgM 或IgG 单独检测时的灵敏度分别为79%和73%，特异度分别为98%和99%；而二者联合检测时，灵敏度和特异度分别达到了88%和98%。进一步检测核酸阴性的疑似患者样本，结果发现IgM和IgG 联检时，该人群中阳性检出率高达66%[21]。这说明，抗体检测对COVID-19 有很好的辅助诊断价值。胶体金法抗体检测具有操作简便、耗时短、灵敏度高等优点，但其缺点是无法进行定量，临床上往往只用于快检初筛。

3.2 酶联免疫吸附测定

与胶体金快速检测法相比，酶联免疫吸附法以其精确定量能力在抗体检测中有独特的优势。近日一项小样本调查研究发现，COVID-19 患者入院时，使用酶免法检测血清中SARS 相关冠状病毒（SARSr-CoV）IgM和IgG 滴度往往较低或呈阴性，而到第5天时，几乎所有患者都出现了抗体阳转或水平升高。其中IgM 阳性率从50%提高到了81%，IgG 阳性率则从81%提高到了100%，而这些患者并非全部可检出核酸阳性[22]。这说明，使用酶免法对SARSr-CoV IgM和IgG 进行检测，可有效提高感染患者检出率，使可能感染新型冠状病毒的人群能被更早鉴别出来。近日，也有基于磁微粒化学发光法的SARS-CoV-2 IgM 或IgG 检测试剂通过NMPA 应急审批。

3.3 抗-SARS-CoV-2 特异性抗体检测的潜在应用价值

根据既往有关SARS-CoV 的文献报道，患者在出现症状后大约一周时血清中即可检测到针对SARS-CoV 的特异性抗体，其中IgM 在感染后数周迅速达到峰值，之后逐渐下降，而IgG 则可在更长时间内维持高水平状态[23-25]。在最近更新的诊疗方案（第七版）中，抗-SARS-CoV-2 IgM和IgG 检测已被纳入，该举措可以弥补单核酸检测假阴性带来的漏诊，使更多患者尽早被筛检出来，实现早诊治、早隔离，避免感染扩散。而且，鉴于SARS-CoV-2为新发病原体，目前对它了解不足，后续的血清流行病学调查仍需进行，抗-SARS-CoV-2 IgG 的检测对于明确其传播途径、流行病学规律和感染转归等具有非常关键的作用。

截至目前，尚未见报道称有患者在急性感染SARS-CoV-2 后发生了慢性化，尽管感染SARSCoV-2 所致的危重患者病死率较高，但危重患者在所有感染者中所占比例并不高，还有相当比例的确诊感染者（病毒核酸检测阳性）无症状或为轻症病例。由此可以推测，COVID-19 很可能属于自限性的感染性疾病，对于这类疾病，建立有效的特异性免疫是机体清除病原体的主要方式，虽然这种免疫反应也很可能引起继发的病理损伤，进而导致患者病情加重。中和抗体是指能消除病毒感染性或细菌毒素生物学效应的抗体，对于SARS-CoV-2来说，中和抗体很可能通过封闭S 刺突蛋白的受体结合区域来阻断病毒感染。Alexandra 等[26]的最新研究发现，SARS-CoV S 小鼠多克隆血清可有效抑制SARS-CoV-2 病毒进入靶细胞，结合COVID-19康复者血清对患者具有显著疗效的临床事实，初步推测机体在暴露于SARS-CoV-2 后的确有可能自发产生中和抗体。如果能通过进一步的临床和流行病学研究确证SARS-CoV-2 感染的自限性，那么SARS-CoV-2 中和抗体的产生是否能够提示病毒已发生清除，这是一个亟需探讨的问题。综上所述，目前将抗-SARS-CoV-2 抗体检测纳入疑似病例排除和确诊标准中是及时且必要的，未来抗-SARS-CoV-2 IgG 能否作为判定治愈的实验室检测指标亦值得考虑。

4 展望

近期NMPA在批准了基于测序和RT-PCR 技术的核酸检测试剂用于临床诊断后，又批准了2个基于胶体金法和2个基于磁微粒化学发光法的SARS-CoV-2 抗体检测试剂盒。抗体检测试剂的推出方便了社区卫生服务中心及基层医院的早筛早诊，增加了检测和诊疗的时效性，进一步满足了疫情高发区对新型冠状病毒感染的实验室诊断需求。考虑到SARS-CoV-2 此前从未在人间流行的事实，诊疗方案（第七版）中加入血清学抗体诊断的内容非常及时，但前提是要保证抗体试剂与其它病原体特别是在人间季节性流行的引起普通感冒的病原体抗体无交叉反应。抗体检测的纳入将有助于减少漏诊，避免疫情进一步扩散，而对这类人群的早诊断早隔离将对当地疫情控制起到极大的积极作用。此外在疫情高发区，针对抗-SARSCoV-2 IgG 的检测是否需要坚持遵守间隔一定时间抗体滴度4倍升高的限制仍值得商榷；最后，在持续开展疫情防控工作的同时，建议及早开展新型冠状病毒感染流行病学调查，这将有利于更好地认识疫情的发生、发展过程，对今后的防疫工作将具有极大的现实意义。