血清HBeAg定量检测技术新进展

陈秀丽 张学东 戴二黑★

近年来，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的实验室检测方法不断涌现和更新，HBV DNA、HBV RNA、HBV 共价闭合环状DNA（covalently closed circular，cccDNA）定量检测、HBV 基因型与基因突变位点检测、乙型肝炎核心相关抗原（hepatitis B core-related HBcrAg）检测方法相继问世并在临床逐渐推广应用。HBV 血清标志物包括乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）、HBeAg（hepatitis B e Antigen，HBeAg）、乙型肝炎e 抗体（hepatitis B e antibody，抗-HBe）、乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，抗-HBc），亦称乙肝五项，由以往的定性检测发展为定量检测，赋予了乙肝五项新的内涵，逐渐被临床所认识。本文对血清HBeAg定量检测技术进展，血清HBeAg定量与HBV 复制、肝组织损伤、病情进展以及抗病毒治疗中的评估作用等方面进行综述。

1 血清HBeAg定量检测技术的进展

截止目前，在乙肝五项检测中，国外进口化学发光免疫分析系统仅能对HBsAg和抗-HBs 进行定量检测，美国雅培（architec）公司检测的样品吸光度比临界值（sample absorbance/cut off，S/CO），瑞士罗氏（elecsys）公司检测样本的临界值指数（cut off index，COI），均为血清HBeAg 检测“半定量”结果，由于没有溯源标准，结果难以进行比较。如果以HBeAg定量参考物质作为定值标准，绘制标准曲线即可实现HBeAg 的绝对定量。由于没有全球通用的参考物质，目前绝大部分研究采用德国Paul-Ehlich Institute 提供的HBeAg 参考物质，单位为PEIU/mL。有学者自建了雅培微粒子酶免分析系统血清HBeAg定量检测方法，这种方法检测范围为0.15～200 PEIU/mL，也可以用胎牛血清对标本稀释后进行检测[1]。此外，还有学者提供了罗氏Elecsys 系统的转换公式，即HBeAg（PEIU/mL）=COI 样本×0.222，此公式可对结果为1～1000 COI 的HBeAg 进行定量，超过1 000 者可用阴性血清1∶40 稀释后再检测[2]。近年来，国内生产厂家在化学发光检测系统的研发方面，实现了对乙肝五项全定量检测，为血清HBeAg 等指标定量检测提供了可靠的技术保障。

2 血清HBeAg定量测定的临床意义

2.1 血清HBeAg定量与HBV 复制的关系

HBV 自然史研究表明，免疫耐受期（immunetolerant，IT）HBV 复制活跃，Chen 等[3]报道慢性HBV 携带者血清HBV DNA与HBeAg定量变化规律呈现一致，血清HBeAg 水平范围很大，相差3个数量级，高水平HBeAg 能有效提示高水平HBV DNA，S/CO为768 的患者中，94%患者血清HBV DNA ＞2107 copies/mL。肝组织HBV cccDNA 较血清HBV DNA 更能准确反映被感染细胞的数量，Thompson 等[4]报 道HBeAg 定 量与 血清HBV DNA、HBsAg 以及肝组织HBV DNA水平显著相关，但是，与肝组织HBV cccDNA 含量的相关系数为0.400 1（P=0.111 5）。张琳等[5]发现HBV 携带者肝组织HBV cccDNA 含量为（5.66±0.93）log 拷贝/mg，血清HBeAg定量为（1 065.80±679.84）PEIU/mL，两者之间无相关性（r=0.152，P＞0.05）。然而，李春艳等[6]证实肝组织HBV cccDNA 含量与血清HBeAg 水平显著相关（r=0.676，P＜0.01）。纳入的研究对象不同，检测方法不统一等因素可能是研究结果不一致的原因，李春艳等[6]采用时间分辨荧光免疫分析法，而其他研究均为化学发光免疫分析法。另外，研究结果也可能与HBV 前-C（pre-C）/基本核心启动子（Basal Core Promoter，BCP）突变以及研究人群的基因型不同有关，血清HBeAg与病毒复制等指标的关系非常复杂，取决于病毒和宿主免疫相互作用的结果。因此，血清HBeAg与肝组织HBV cccDNA 含量的关系尚需要进一步研究来证实。

2.2 PC/BCP 突变对血清HBeAg定量的影响

HBeAg 可诱导免疫耐受，因而HBeAg 的减少可能和免疫耐受打破有关。HBV 前-C 区ntG1896A 点突变，可以导致第28位氨基酸（aa28）由色氨酸TGG 变为终止密码TAG，能阻断HBeAg的合成，从而造成HBeAg 转阴而抗-HBe 阳转[7]，而且，1896 变异的发生具有HBV 基因型依赖性：B～E 基因型的G1896与T1858 配对所形成的结构不稳定，nt1896 的G 变异为A 使结构变得稳定；而A和F 基因型的nt1858 是C，与G1896组成较稳定的C-G 对，故很少发生前C 区ntG1896A 变异。HBeAg 及其前体翻译自3.5 kb 的前C mRNA，而BCP 调节该mRNA的转录。BCP 变异会降低前C mRNA的转录效率，进而影响HBeAg 前体的表达，造成HBeAg 阴性血清表现型的HBV 感染[8]。

B 基因型与C 基因型相比，B 基因型易发生PC 突变，而C 基因型易发生BCP 突变。有研究证实HBeAg 阳性慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者中，PC/BCP 突变患者血清HBV DNA水平明显低于野生型患者[9-11]。Thompson 等[4]发现在61例HBeAg 阳性CHB 患者中，野生型仅有27例，PC 突变、BCP 突变、PC/BCP 同时突变者分别为10、22、2例，PC/BCP 突变患者血清HBeAg 水平明显低于野生型患者。用血清HBV DNA 校准后这种差异依然存在，提示由于基因突变而并非HBV DNA 复制的抑制造成HBeAg 水平降低。因此，PC/BCP 突变株的出现是造成血清HBeAg定量水平降低甚至阴性的原因之一。

2.3 基线血清HBeAg定量与HBeAg 自发清除密切相关

围生期HBV 感染者的HBeAg 自发消失率很低，HBeAg/抗-HBe 自发血清学转换主要出现在免疫清除期（immune-clearance，IC），年发生率约为2%～15%，HBeAg 阴转或者HBeAg/抗-HBe 血清学转换的患者每年只有约1%发展为肝硬化，并且在HBeAg 血清学转换后，HBsAg年清除率约为0.5%～1%，而HBeAg 未阴转的患者血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）波动较小，HBV DNA 呈现高水平[12]。Song 等[13]报道随访1年时HBeAg/抗-HBe 血清学转换比例为15.9%（18/113），28 周时HBeAg定量为1.53 log PEIU/mL 的界限值，用于确定1年时HBeAg/抗-HBe 自发血清学转换的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为94.4%、60.0%、30.9%、98.3%。因此，HBeAg/抗-HBe 自发血清学转换与患者HBV 基因型、年龄、血清ALT 水平以及基线HBeAg定量水平有关。

2.4 血清HBeAg定量与肝组织损伤的关系

有研究显示，血清ALT 水平可以反映肝细胞炎症损伤程度，血清HBeAg定量高时，ALT水平呈现下降[14]。Li等[15]报道IT期患者高水平HBeAg 持续时间长，ALT 正常，肝组织学无明显异常或轻度炎症坏死及缓慢肝纤维化的进展，IC 期机体针对HBV 免疫应答强烈，被HBV 感染的肝细胞受免疫攻击而减少，从而HBeAg 水平降低，ALT持续或间歇升高，IC 期的ALT与血清HBeAg定量水平呈负相关（β=-0.290，P=0.018）。Zeng 等[16]证实血清HBeAg定量水平与IC 期患者的肝组织炎症分级及肝纤维化分期显著相关，相关系数分别为0.304和0.371，（P＜0.001）。因此，血清HBeAg定量与肝组织损伤程度呈现负相关。

2.5 血清HBeAg定量在判断慢性HBV 感染者病情进展中的意义

乙肝相关肝硬化、肝癌患者的HBV DNA、HBeAg 水平较慢性乙型肝炎患者降低，提示血清HBV DNA、HBeAg 水平与乙型肝炎疾病的进展程度呈负相关。IT 患者HBsAg和HBeAg定量水平高，HBV DNA 通常高于200 000 IU/mL；IC 患者血清HBeAg 水平低于IT 期，多数可达到HBeAg 血清学转 换和HBV DNA 抑制[17]。Wang 等[18]报道IT和IC 期HBeAg 水平分别为（1317.9±332.9）S/CO和（673.4±562.1）S/CO，P＜0.001，ROC曲线分析数据显示，HBeAg ＞1 118.96 S/CO 可以区分IT和IC 期的敏感度为85.2%，特异度为75%。因此，血清HBeAg定量可以监测和判断患者病情变化，以及区分自然病程的分期。

2.6 血清HBeAg定量在CHB 患者抗病毒治疗中的评估作用

2.6.1 血清HBeAg定量在聚乙二醇化干扰素（Pegylated interferon，PEG-IFN）治疗中的预测价值

在PEG-IFN 治疗过程中进行HBsAg和HBeAg定量检测，可以更好地预测持久病毒学应答甚至HBsAg 转阴或血清转换。基线特征指导治疗（baseline-guided-therapy，BGT）策略可以识别干扰素治疗的优势患者，基线HBeAg定量可以预测患者抗HBV 治疗效果，从而优化治疗方案。Fried等[19]报道PEG-IFN 治疗48 周的HBeAg 阳性CHB患者，基线HBeAg＜31 PEIU/mL、HBeAg 31～1 294 PEIU/mL、HBeAg＞1 294 PEIU/mL 3组患者在治疗结束时，HBeAg/抗-HBe 血清学转换率分别为54%、26%、24%（P＜0.001，95% Cl 1.33～2.4）。应答指导治疗（reponse-guided-therapy，RGT）策略根据PEG-IFN 治疗早期（12 周或24 周）的应答情况，预测停药后持久应答，指导治疗方案的调整。Tangkijvanich 等[20]报道PEG-IFN 治疗24 周时，HBeAg下降大于2.0 log，是预测1年内持续病毒学应答和HBeAg/抗-HBe 血清学转换的界限值，敏感性和阴性预测值分别为85%和92%。一项亚洲研究证实，PEG-IFN 治疗12 周或24 周时检测HBeAg定量，对HBeAg/抗-HBe 血清学转换同样具有良好的预测价值[21]。因此，在治疗前及治疗过程中密切监测HBeAg定量，可早期、及时预测HBeAg 血清转换，有助于优化治疗方案。

2.6.2 血清HBeAg定量在核苷（酸）类似物（nucleoside analogues，NAs）治疗中的预测价值

NAs 能够有效地抑制HBV 复制，但血清HBeAg/抗-HBe 转换率不高[22]。Wong 等[23]研究发现替诺福韦（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）治疗384 周时HBeAg/抗-HBe 血清学转换率为52%，基线和治疗24 周时HBeAg定量分别为1.63 log PEIU/mL和0.90 log PEIU/mL，可以预测HBeAg/抗-HBe 血清学转换（P=0.002），并且治疗24 周时HBeAg定量下降大于2.2 log与 基因A 或D型患者的HBsAg 消失相关（38%vs15%，P=0.03）。Shin 等[24]报道恩替卡韦（entecavir，ETV）治疗3年的HBeAg/抗-HBe 血清学转换率为31.7%。Kwon等[25]发现基线HBeAg定量＜360 PEIU/mL，以及治疗12 周时HBeAg 下降超过1 log，可以预测治疗1年的病毒学应答和HBeAg/抗-HBe 血清学转换。因此，在NAs 治疗过程中，检测血清HBeAg 基线水平、动态监测治疗早期某些时间点HBeAg 水平及下降幅度，对于预测抗病毒疗效具有重要意义。

3 小结与展望

HBeAg定量检测是近年来乙肝血清学标志物检测技术的重要发展，是HBV DNA 定量检测的补充，基线HBeAg定量可预测PEG-IFN和NAs的疗效；治疗过程中实时监测HBeAg 降低幅度，可更加精准预测抗病毒药物疗效，指导临床医师制定和优化治疗方案。全自动化学发光免疫分析法是建立在信号示踪之上的技术，检测血清HBeAg定量，具有灵敏度高，操作简便、快速，结果稳定，标准曲线剂量宽等优点，因此在临床工作中值得普遍推广。