食品中化学性有害物的质谱软电离裂解规律及筛查技术研究进展

刘晓敏, 许秀丽, 聂雪梅, 国 伟, 张 峰*

(1. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 中国医科大学, 辽宁 沈阳 110122)

民以食为天,食以安为先,食品安全事关国计民生。但近年来,食品安全形势严峻,事件频发[1]。据世界卫生组织2019年统计,每年由于不安全食品的影响导致的低收入和中等收入经济体的生产损失高达950亿美元。2006～2015年由化学性有害物导致的食品安全事件占比达85% ,如三聚氰胺事件重创我国乳品行业,启动了国家安全事故最高级响应,严重影响了我国人民身体健康和国家经济安全[2];塑化剂事件则造成包括中国在内的多个国家的巨大经济损失[3]。这些都是由于食品中化学性有害物,特别是未知化学性有害物层出不穷引起的严重的食品安全事件。因此,未知化学性有害物的发掘和检测成为食品安全科技的重大议题。

近年来,质谱在食品中化学有害物检测方面发挥着越来越重要的作用[4,5]。质谱联用技术,如气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS),是近年来食品安全领域中对特定目标化合物分析最常用的有力手段[6,7]。基于质谱的靶向多残留筛查方法可以用于分析食品中的化学有害物[8,9],也是目前最常采用的定向筛查策略[10,11],但传统检测技术往往是事后被动式的,导致未知新型有害物难以发掘。在已知结构骨架上衍生是未知新型化学性有害物的主要来源,研究同类结构化合物的质谱裂解规律,如中性丢失、特征离子碎片等的产生规律,以此为突破口,对建立同类结构未知新型有害物的发掘和检测技术具有重要的理论支撑意义[12-14]。

质谱电离技术包括电子轰击电离(EI)等硬电离技术,和电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)等软电离技术。其中在质谱硬电离方面,美国国家标准与技术研究院(NIST)建立了质谱数据库,对食品中挥发性有害物的裂解机理已经基本阐明。但近年来,国内外学者越来越关注质谱软电离方面,分别对重要的化学性有害物,如农药、兽药、污染物等的裂解机理及其在食品中化学性有害物的检测应用方面进行了探讨。

本文按照结构类别,对食品中重要化学性有害物(包括农药、兽药、真菌毒素等)的质谱软电离裂解机理进行了综述,重要裂解机理包括中性丢失、开环反应、α-断裂、重排反应等。同时对质谱软电离机理在食品中化学性有害物的非目标筛查和未知化学性有害物的发掘检测的应用进行了综述,可以为食品中同类结构新型物质的发掘提供理论依据[15-17]。

1 食品中化学性有害物的软电离质谱裂解规律

食品中化学性有害物的硬电离裂解机理已经基本阐明,但仅涵盖农药等易挥发性有害物,占化学性有害物的比例不到15% ;大量农药、兽药、添加剂等非挥发性化学性有害物的软电离质谱裂解规律还未系统化阐述。本文从化合物的化学结构出发,综述这些化学物的软电离质谱裂解规律[18-20]。

1.1 农药

农药是指农业上用于防治病虫害及调节植物生长的化学药剂。农药类质谱软电离裂解规律主要有烷基链断裂、中性丢失、重排反应等。根据结构类型,农药可分为有机磷类、唑类和氨基甲酸酯类等[18,19]。

1.1.1 有机磷类

有机磷类农药(organophosphorous pesticides)包括磷酸盐类、磷酸酯类和硫代磷酸酯类等。其分子式为(P=Z)(OR1)(OR2)R3。其中,Z为氧或硫;一般R1和R2相同,多为甲氧基或乙氧基,也可为甲硫基或乙硫基等;R3为烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫等。大多数有机磷类适用于GC-MS分析[20];在LC-MS中,有机磷类可以使用ESI或APCI进行离子化。在ESI正电离模式下,磷酸酯的3个不同键和磷酸盐的2个不同键(P-O、O-R、P-R)可能发生断裂(见图1a)。C-O键的裂解取决于连接在氧原子上的烷基链,当所有取代基都不是甲基时,将丢失最小的烷基链(具有最低的质子亲和力)。对于磷酸酯和磷酸盐,如果烷基链是甲基,由于与磷连接的甲醇基的相关质子亲和力,裂解将发生在含有甲基的P-O键上,从而导致CH3OH的丢失[21]。因此有机磷农药在质谱条件下可能发生烷基链断裂、脱水等现象,产生多种特征子离子,如PO4H3(CH2)m、PO3SH3(CH2)m、PO2S2H3(CH2)m(m=0, 1, 2, …)等[22]。

1.1.2 唑类

图 1 典型农药的质谱软电离裂解规律Fig. 1 Fragmentation mechanisms of mass spectrometry soft ionization of the typical pesticides-----: main bond cleavage of compounds.

1.1.3 氨基甲酸酯类

氨基甲酸酯类农药(carbamate pesticides)包括芳基N-甲基氨基甲酸酯、肟N-甲基氨基甲酸酯、N-2-丙基氨基甲酸酯和N-苯基氨基甲酸酯。LC-MS是氨基甲酸酯类的首选分析方法,因为此类化合物具有热不稳定性。氨基甲酸酯类物质以ESI正电离模式分析时,N-甲基氨基甲酸酯在质谱条件下显示特定的基团丢失,失去异氰酸甲酯(CH3-N=C=O),形成[M+H-57]+的离子峰。而在氨基甲酸二甲酯(吡虫威)的MS/MS图谱中,除了发生中性丢失44(CO2)和57 Da,还可以观察到重排反应的发生。这是由于丢失CO2需要重排二甲胺基,而CH3-N=C=O的丢失需要甲基重排(见图1c)[23]。

1.2 兽药

兽药常被用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能。兽药类质谱软电离裂解规律主要有中性丢失、侧链断裂、开环反应等。根据结构可分为磺胺类,苯乙醇胺类,氨基糖苷类,喹诺酮类,β-内酰胺类等。

1.2.1 磺胺类

磺胺类药物(sulfonamides)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称,是常用的一类抗菌药物。磺酰胺N上连接不同的基团(R基)形成了不同的磺胺类化合物[24]。磺胺类化合物的主要质谱裂解在-SO2-两端进行,失去R基是磺胺类化合物的裂解途径之一。在ESI正电离条件中产生[M+H]+分子离子,在质谱裂解过程中以-SO2-NH-基团为中心,发生S-N键的断裂(见图2a),产生特征离子m/z156、108和92[25,26]。而在负离子模式下,各种结构的磺胺通过中性分子丢失和弱键断裂产生m/z77.965 5 和 79.981 2 的特征离子[27]。另外大多数磺胺还有一些特征的中性分子丢失如SO2、HCl等。

1.2.2 苯乙醇胺类和芳氧丙醇胺类

苯乙醇胺类(phenylethanolamines)和芳氧丙醇胺类(aryloxypropanolamines)都是结构中具有碱性羟基侧链的化合物,可以作为β-受体激动剂和β-受体阻滞剂使用[28,29]。苯乙醇胺类化合物的一般结构为苯环上连接β-羟基侧链,在ESI正电离模式下易于获得质子,形成[M+H]+的准分子离子,形成[M+H]+后的一般裂解途径为:中性丢失H2O,形成与苯环共轭的碎片离子;脱去与苯乙醇胺的-NH-相连的基团,发生α-断裂形成碎片离子(见图2b)[30,31]。芳氧丙醇胺类化合物的一般结构为1-烷基氨基-3-苯氧丙基-2-醇;烷基为异丙基的,如阿替洛尔和普萘洛尔等;烷基为叔丁基的,有噻吗洛尔或塔利洛尔等。芳氧丙醇类化合物的质谱裂解,一般特征包括H2O的丢失,以及氨基侧链的裂解(见图2c)。对于烷基为异丙基的洛尔类物质,此类化合物大多有m/z116离子;对于叔丁基取代的化合物如噻吗洛尔等,大多可以观察到m/z74离子[12,32]。

图 2 典型兽药的质谱软电离裂解规律Fig. 2 Fragmentation mechanisms of mass spectrometry soft ionization of typical veterinary drugs

1.2.3 氨基糖苷类

氨基糖苷类(aminoglycosides)化合物的结构是两个或多个氨基糖通过糖苷键连接到一个氨基环糖醇支架上,是一类广谱抗生素[33]。有两种类型的氨基环糖醇结构:链霉胍和脱氧链胺。在ESI正电离模式下,大多数氨基糖苷类的分子离子取决于流动相的组成,可能同时显示双电荷离子[M+2H]2+和单电荷离子[M+H]+[34]。在负离子ESI-MS中,在高pH反相色谱条件下,可以观察到去质子化的分子离子[M-H]-。化合物碎片离子的相对丰度可能会有所不同,具体取决于单电荷或双电荷前体离子是否断裂。例如单电荷链霉素和二氢链霉素中最丰富的碎片离子是m/z263和245;而在双电荷离子中,最丰富的离子是链霉素的m/z176和263,以及二氢链霉素的m/z176和409。以正电离模式下的庆大霉素为例,质谱图中可以观察到3个主要的碎片离子:m/z160是由于氨基葡萄糖单元的存在;m/z163是由于2-脱氧链胺单元的存在;而由于紫胺单元的存在,庆大霉素5种C族化合物中C1a的质谱图中可以观察到m/z129离子,庆大霉素C2、C2a和C2b的质谱图中可以观察到m/z143离子,庆大霉素C1的质谱图中可以观察到m/z157离子。另外,由于丢失了一个紫胺单元,可以产生m/z322的离子。这些碎片离子随后损失的H2O、NH3或CH3NH2导致三级碎片离子的产生。对于大多数的氨基糖苷类化合物,m/z163是特征离子(见图2d)[35]。

1.2.4 甾体类

甾体类(steroids)化合物是广泛分布于生物界、具有环戊烷多氢菲基本骨架的一大类化合物的总称。在哺乳动物中,甾体类化合物起着激素的作用,分类为:(1)性类固醇,如雄激素、雌激素、孕激素;(2)包括糖皮质激素在内的皮质类固醇;(3)合成代谢类固醇[36,37]。甾体类的特征是4个稠合的环:3个环己烷环(分别称为A、B和C环)和一个环戊烷环(D环)。甾体类容易连续失去羰基氧基团,环上的羰基氧和侧链上的羰基氧很容易被消除而产生脱水离子(见图2e)。通过损失羰基氧形成脱水离子,然后发生开环反应,形成一系列稳定的共轭结构碎片离子[38,39]。张婷岚等[40]使用电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS),在负离子模式下,对5种雌激素类化合物的质谱裂解规律进行研究;结果表明,5种化合物具有相似的电喷雾裂解行为,在质谱裂解过程中,首先失去C-17位上的氧原子,然后连续断裂D环和C环,开环后重新排列,进而形成稳定的共轭结构,最终得到高丰度的特征碎片离子m/z183(181)、169、145(143),这些特征碎片有助于甾体激素类化合物的结构解析。

1.2.5 喹诺酮类

喹诺酮类(quinolones),又称吡酮酸类或吡啶酮酸类,是一类合成抗菌药。此类物质含有羧基、酮基,因此质谱碎裂途径主要有脱水和丢失CO2反应[41]。在Dorival-García等[42]的研究中,15种喹诺酮化合物在ESI正电离模式下的主要产物离子是[M+H-H2O]+,这是由C-3位的羧酸丢失一分子H2O形成的。对于大多数喹诺酮类药物,还会有[M+H-CO]+或[M+H-CO2]+的离子峰,这可能是由C-4位-C=O或C-3位-COOH裂解产生的(见图2f)。另外,氟喹诺酮类,如达诺沙星、恩诺沙星、环丙沙星,均具有[M+H-HF]+或丢失CH=CH-NH2分子的质谱峰,推测是由C-6氟、C-7位哌嗪环裂解产生[42,43]。

1.2.6β-内酰胺抗生素类

β-内酰胺类(β-lactams)抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素,包括最常用的青霉素与头孢菌素,以及其他非典型β-内酰胺类抗生素。该类化合物质谱裂解途径主要是分子内脱羧基反应、四元内酰胺环裂解反应,及侧链结构中C-S键的裂解反应[44,45]。Hong和Zhang等[45]使用高分辨质谱测定肉制品中的44种头孢菌素,40种头孢菌素在加热电喷雾电离(HESI)正电离模式下有响应,而4种头孢菌素(头孢呋辛、头孢尼西、头孢西丁和头孢特仑酯)以负电离模式电离;在这项研究中,四极杆/静电场轨道阱(Q-Orbitrap)用于获取化合物分子离子和二级碎片离子的精确质量,提高了分析的选择性和准确性;研究者发现,有30个头孢菌素具有相同的产物离子m/z167.02、156.05、141.01(见图2g),这些产物离子可以用来识别标记头孢菌素。徐雨等[46]研究了16个头孢菌类药物在ESI负电离模式下的裂解途径,发现此类化合物的断裂主要为β-内酰胺环断裂,及氢化噻嗪环裂解失去一分子H2S;当C-3上侧链结构为烷烃或烯烃时,侧链不易断裂;而C-3位上侧链为醚或硫醚时,侧链易断裂并与C-5形成三元环或与C-2位上的羧基形成五元内酯环。

1.3 真菌毒素类

真菌毒素污染过的食品,不但品质会受到影响,对人类健康的威胁更是不容置疑。真菌毒素类质谱软电离裂解规律主要有α-断裂、中性丢失等。根据结构类型,真菌毒素可分为黄曲霉毒素、麦角生物碱和单端孢霉烯族毒素等[47,48]。

黄曲霉毒素(aflatoxins)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素。吴寒秋和张峰等[49]对山银花中4种黄曲霉毒素的裂解规律进行了讨论。这4种化合物在ESI正电离模式下都可以形成[M+H]+、[M+Na]+及[M+K]+3种母离子。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2均为二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲霉毒素B1结构中有内酯的结构,C-O键键能相对较低,易中性丢失一分子CO2(见图3a)。另外,脂环酮经过α-断裂和i-断裂,环开裂后发生中性丢失(-CO)。化合物中苯甲醚的结构也易发生断裂,失去一个甲基,得到的碎片离子还可以继续裂解失去CO。

1.3.2 麦角生物碱类

麦角生物碱(ergot alkaloids)是麦角菌属感染小麦、大麦等谷物产生的以麦角酸为基本结构的一系列生物碱衍生物。摄入含有麦角生物碱的食物会引起人和动物中毒,造成健康损害。麦角生物碱通常包括麦角酰胺、麦角肽碱(或麦角肽)。Arroyo-Manzanares等[50]基于高分辨质谱和多级质谱研究了谷物中9种麦角生物碱的裂解规律。他们发现所有的麦角生物碱在HESI正电离模式下均具有m/z223和251的特征碎片,同时在裂解的时候丢失H2O、CO等中性分子(见图3b)。

图 3 典型真菌毒素的质谱软电离裂解规律Fig. 3 Fragmentation mechanisms of mass spectrometry soft ionization of typical mycotoxins

1.3.3 单端孢霉烯族毒素类

单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)是受到镰孢菌、头孢霉等细菌污染的小麦和玉米等谷物中产生的一类生物活性和化学结构相似的代谢产物。单端孢霉烯组毒素的基本化学结构是倍半萜烯,又称12,13-环氧单端孢霉烯族化合物。由于在C3、C4、C7、C8、C15位上取代基的不同,主要形成4类不同的化合物。比较常见的是T-2毒素为代表的第一类和以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为代表的第二类化合物。Liu等[51]在研究中发现,A型单端孢霉烯族毒素,例如T-2毒素和HT-2,在ESI正电离模式下以[M+Na]+形式存在;而B型单端孢霉烯族毒素,例如脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇,在ESI负电离模式下以[M-H]-形式存在。消除异戊酰氧基和乙酸是T-2毒素和HT-2毒素的主要裂解途径(见图3c);环氧裂解是脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的主要裂解途径。

1.4 其他化学污染物

食品中的其他化学污染物包括食品生产、加工等过程中产生的污染物,如双酚类、邻苯二甲酸酯类和杂环胺类等。

1.4.1 双酚类

（5）不锈钢地铁侧墙单元电磁吸附压紧工装研究 根据焊接工艺试验结果表明，电磁场的加入有利于激光焊接焊缝性能的提升，现车生产具备使用电磁吸附压紧工装完成侧墙单元激光焊接的条件。根据现车激光焊缝特点，结合电磁吸附工装原理，针对现有侧墙单元激光焊接结构，研究可应用于现车的新型侧墙单元装配压紧工装结构及规格参数，进行侧墙单元电磁吸附工装概念设计。

双酚类(bisphenols)是指具有两个酚基团的环氧衍生有机物,是制造食品接触材料的重要原料。Cheng和Zhang等[52]研究乳制品中21种双酚化合物的裂解规律,发现双酚化合物可以在ESI负电离模式下产生[M-H]-离子,双酚二环己基醚及其衍生物则倾向于在正电离模式下形成[M+K]+、[M+Na]+、[M+NH4]+加成离子;这项研究中显示了双酚Z可能的裂解途径,观察到特征产物离子(m/z223)源自六原子环([M-H-C3H6-H2]-)的σ裂解,最大丰度离子m/z145([M-H-C6H5OH-C2H4]-)是由于羟苯基-烷基键的断裂和连续的六原子环的α断裂而导致的(见图4a)。Zhao等[53]研究了9种双酚ESI负电离模式下的质谱碎片,发现6种双酚有m/z93(C6H5O)离子,5种双酚丢失酚基(C6H5OH), 4种双酚形成[M-H-CH4]-离子。

1.4.2 邻苯二甲酸酯类

邻苯二甲酸酯类(phthalates)作为增塑剂,被广泛地应用于日常生活中,在使用过程中,容易发生迁移,造成对食品、土壤等的污染[54]。在ESI正电离条件下,邻苯二甲酸酯类物质主要裂解途径是烷氧基的断裂。此裂解途径涉及羰基氧攻击邻羰基碳,从而导致邻苯二甲酸酐的形成,生成m/z149 (C8H5O3)离子(见图4b),邻苯二甲酸酐再失去一分子CO后,生成苯甲酸,后断裂羧基,生成m/z77 (C6H5)离子。因此m/z149、77等可以作为该类化合物的定性离子[55]。

图 4 其他化学污染物的质谱软电离裂解规律Fig. 4 Fragmentation mechanisms of mass spectrometry soft ionization of other chemical pollutants

1.4.3 杂环胺类

富含蛋白质的食物在烹调中会形成一组多环芳胺化合物,这类物质主要是复杂的杂环胺类(heterocyclic amines)化合物。杂环胺结构中含有杂环,通常杂环上连接有甲基,因此这类物质主要通过丢失-CH3、-CN等发生裂解,形成[M+H-CH3]+等离子(见图4c)[56,57]。

2 基于裂解规律非定向筛查技术

2.1 基于高分辨质谱数据库的已知物筛查技术

高分辨质谱数据库的已知物筛查技术是指,基于标准化合物分子离子质荷比、二级碎裂片段的质荷比与保留时间等,对待测化合物进行非定向筛查[58]。He等[59]基于源内裂解,使用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)建立了一种高效农药残留物筛查和定量方法,测试了400多种农药,其中96种农药表现出源内裂解现象;建立了包含403种农药和126个片段的高分辨率MS/MS库,并将其用于蔬菜和水果中农药残留的分析检测,成功避免了假阴性结果的出现。贾玮等[60]采用基于高分辨的数据依赖采集技术,对585种农药化合物二级碎裂片段进行研究,得到不同类别农药的特征断裂片段;将特征断裂片段与标准数据库相结合,构建非定向筛查方法,用于市售乳制品中农药的非定向分析,发现了样品中含有前期未检出的嘧菌酯与草克乐,非定向筛查分析方法的建立可快速筛查鉴定乳制品中农药。Cheng和Zhang等[52]基于双酚类化合物的裂解规律，建立了高通量筛查乳制品中的21种双酚类化合物的方法；该方法用于实际样品中双酚类化合物的检测，检测到12种目标化合物。郭天洋等[22]采用基于中性丢失和特征离子的敞开式离子化技术建立了一种快速筛查食品中唑类和有机磷类农药的分析方法，通过对目标物在纳喷离子源(NSI)正电离模式下产生的子离子和中性丢失进行归纳，建立了目标物的共性特征离子和中性丢失库，可实现食品中唑类和有机磷类农药的筛查和识别。

2.2 基于标志物碎片和中性丢失的未知物发掘技术

具有相同母核的同一类化合物,在二级质谱碎裂过程中会表现出相似的行为特征。通过扫描化合物的特征碎片和中性丢失可以发现未知的同类化合物。Zhang等[61]通过研究加工食品中13种杂环胺的裂解规律，在烤鱼中发现了一种新型的杂环胺，经鉴定为Trp-P-1的异构体。Hong和Zhang等[45]基于头孢类化合物的标志性碎片(m/z167.02、156.05、141.01)，筛查肉制品中44种头孢类化合物，并在羊肉样品中检测出新的头孢类化合物。Cheng和Zhang等[32]开发了一种高分辨率质谱结合特征离子筛查奶粉样品中的27种β-受体阻断剂的方法；研究发现在HESI正离子模式下，特征离子碎片(m/z116、98、74等)可以用于非靶向筛查实际样品中未知的β-受体阻断剂；结果在样品中检测到未知的β-受体阻断剂，经鉴定为二醋洛尔的异构体。Sun和Zhang等[62]通过使用多个中性丢失扫描技术结合亚结构识别的方法，全面表征了沙棘样品中的五环三萜类化合物；实验研究了正负离子模式下的25种五环三萜标准品的裂解机理；在HESI正离子模式下，使用多个中性丢失扫描(18、28和44 Da)可发现沙棘样品中的新型同类化合物，最终鉴定出15种新型五环三萜类化合物。

3 总结和展望

本文综述了食品中的主要化学有害物的裂解规律,对包括兽药、农药以及真菌毒素等的目标分析物的质谱机理进行了阐述。质谱碎裂机理主要包括中性丢失、开环反应,α-断裂、重排反应等。归纳这些特征,有助于识别该类未知化学性有害物的化学结构。基于食品中的化学有害物的裂解规律,可以建立逐类筛查策略,用于化合物的非定向筛查;前体离子和中性丢失扫描方法,还可以用于发现食品样品中新型同类化合物。另外,特定的碎裂片段也可进一步提高靶向分析特定类型化合物的选择性,并有助于鉴定相关药物的代谢物,可以为食品中同类结构新型物质的发掘提供理论依据。