超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法非靶向筛查西红柿中三唑类杀菌剂

2020-05-22雷汝清牛宇敏郭巧珍丁晓静

色谱 2020年7期

雷汝清, 牛宇敏, 郭巧珍, 邵兵, 丁晓静*

(1. 首都医科大学公共卫生学院, 北京 100069; 2. 北京市疾病预防控制中心, 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室, 北京 100013; 3. 北京市预防医学研究中心, 北京 100013)

我国生产和使用的三唑类农药达20多种[1,2],作为一种高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂,三唑类农药被广泛用于多种病害防治[3],是目前销量最大且最有发展前景的一类杀菌剂。然而在农作物种植、加工、贮存等过程中过量或不当施用,已造成这类物质残留在农作物和环境中[4],并通过食物链,在动物组织中富集和累积[5],可能扰乱人体内分泌,具有致突变作用[6]。其中烯效唑、己唑醇、戊唑醇、丙环唑和氟环唑被美国环保署列为可能的人类致癌物[7,8]。我国食品安全标准[9]中仅规定了部分三唑类杀菌剂在食品中的限量标准,与美国[10]、欧盟[11]等地法规存在差异,表1为我国、美国和欧盟对西红柿中三唑杀菌剂的限量标准。此外,随着全球杀菌剂需求的增长,新型三唑类杀菌剂的研发和应用具有广阔前景,但其健康风险仍需评价。为应对国际贸易法规差异以及新型化合物发现和预警需求,有必要建立食品中三唑类杀菌剂的非靶向快速筛查方法。

目前,文献报道的土壤、水体、植物性样品及肉类样品中一种或几种三唑类杀菌剂的测定均为靶向测定[5,12-15],无法对法规差异或者新型三唑类杀菌剂进行快速非靶向筛查。基于特征碎片或特征中性丢失的高分辨质谱已被用于食品中有机磷类和唑类农药[16]及合成阿片类药物[17]等的筛查[18]。文献[16]根据精确质荷比为 70.039 97 的共性特征离子来判断三唑类农药。本研究在此基础上,加入共同中性丢失以及更多样的共同特征碎片离子,能够更精确地筛查三唑类杀菌剂。孙东明[19]结合量子化学计算对三唑类杀菌剂的质谱解离机理进行研究,将14种三唑类杀菌剂按主链结构的不同分成6类并分析其质谱解离机理。本文依据GB 2763-2019[9]选取19种三唑类杀菌剂为研究对象,根据主链结构差异将三唑类杀菌剂分为8类。选取每一类中1种代表性化合物,分析质谱裂解途径并总结裂解规律,用其余的11种三唑类杀菌剂标准品对裂解规律进行验证,其中三环唑和腈菌唑的裂解途径与文献[19]进行了对比,并解析了文献[19]未解析的6种三唑类杀菌剂的质谱裂解途径。将此裂解规律应用于西红柿中该类物质的非靶向筛查,为三唑类杀菌剂残留的快速筛查提供参考。

表 1 中国、美国和欧盟对西红柿中三唑类杀菌剂残留的限量Table 1 Limits of triazole fungicide residues in tomatoes in China, the United States and the European Union

-: no clear limits of triazole fungicides in tomatoes.

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱仪(Acquity UPLC I-Class,美国Waters公司);离子淌度四极杆飞行时间质谱仪(Vion IMS Q-TOF,美国Waters公司);超纯水器(Milli-Elix/RiOs,美国Millipore公司)。

19种三唑类杀菌剂标准品:三环唑、唑嘧菌胺、氟硅唑、戊菌唑、三唑酮、烯唑醇、烯效唑、多效唑、戊唑醇、粉唑醇、四氟醚唑、腈菌唑、氟环唑、糠菌唑、苯醚甲环唑均购自美国AccuStandard公司(100 mg/L);亚胺唑购自美国AccuStandard公司(50 mg/L);腈苯唑、丙环唑购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;环丙唑醇购自美国Sigma-Aldrich公司,纯度均大于97% 。质谱纯乙腈购自美国Honeywell公司;甲酸(分析纯)购自北京J&K公司。QuEChERS试剂管(2 mL,含PSA 50 mg, C1850 mg,无水硫酸镁150 mg,购自中国Dikma公司)。16份西红柿样品购于北京某超市。

1.2 标准溶液配制

19种三唑类杀菌剂标准储备液:分别准确称取丙环唑、腈苯唑、环丙唑醇这3种标准品各10.0 mg,用乙腈溶解并稀释定容至10 mL,配制成 1 000 mg/L 的储备液,其余16种化合物均以购买的原液作为储备液,于-20 ℃保存,备用。

标准工作溶液:使用时将各单标分别用10%(v/v)乙腈水溶液稀释,配制成10 mg/L 标准溶液,于4 ℃保存,备用。11种化合物的混合标准溶液中粉唑醇、氟环唑、三唑酮、四氟醚唑、丙环唑、腈苯唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、烯效唑、烯唑醇、多效唑的质量浓度均为1 mg/L。

1.3 色谱和质谱检测条件

色谱条件:色谱柱为Acquity UPLCTMBEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国Waters公司);柱温:50 ℃;样品室温度:4 ℃;进样体积5 μL。流动相A相为0.1% (v/v)甲酸水;流动相B相为0.1% (v/v)甲酸乙腈;流速为0.45 mL/min。梯度洗脱程序:0～0.5 min, 2%B; 0.5～5.9 min, 2%B～99%B; 5.9～6.1 min, 99%B; 6.1～6.3 min, 99%B～2%B; 6.3～7.0 min, 2%B。

质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子模式;毛细管电压:1.00 kV;锥孔电压:40 V;离子源温度:120 ℃;碰撞气:氮气;脱溶剂气温度:500 ℃;脱溶剂气流量:800 L/h;碰撞能:低能6 eV,高能15～60 eV;扫描范围:50～1 000 Da;扫描方式:采用MSE模式采集数据。为保证质量数精度,以亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephalin, 0.25 mg/L,m/z556.276 6)进行实时质量校准。

1.4 样品前处理

参照文献[9]方法处理样品:将西红柿样品可食部分切碎,混匀封闭,避光备用。

准确称取1.00 g(±0.05 g)处理好的西红柿样品于15 mL离心管中,加入2 mL乙腈,涡旋1 min,超声提取10 min, 9 000 r/min 离心10 min。取1.0 mL上清液加入QuEChERS试剂管中,涡旋1 min, 14 000 r/min 离心5 min。吸取上清液过0.22 μm滤膜,供UPLC-Q-TOF MS进样分析。

1.5 筛查方法

采用UNIFI软件对原始数据进行处理,通过MSE扫描模式,获得化合物的精确相对分子质量和二级质谱数据,解析裂解规律。UNIFI软件中有一功能为利用共同碎片离子和共同中性丢失筛查可疑化合物的应用模块,将分析出的裂解规律应用于该模块,可实现对实际样品中采集到的数据进行三唑类杀菌剂残留筛查分析。检索参数为:共同离子碎片精确质量偏差为±2.0 mDa;共同中性丢失精确质量偏差±4.0 mDa。设置检索条件:1.共同碎片模式:a.候选化合物中含有设置的共同碎片离子(三环唑:m/z163.032 4、m/z136.021 5;唑嘧菌胺:m/z249.207 4、m/z176.093 1、m/z149.082 2;三唑环作为取代基:m/z70.034 0;含取代苯结构:一元卤素取代m/z125.015 3、m/z89.038 6,二元卤素取代m/z122.999 6、m/z89.038 6); b.候选化合物中检测到共同中性丢失(C2H3N3、C2H2、C2H4、C3H4、C3H6、C4H10、C4H6、C4H8、C6H5Cl、CH4、C7H16、 CO、HBr、HCHO、HCl、HCN、HF)。候选化合物需同时满足1a、1b两个条件。2.对比模式:a.满足条件1的候选化合物仅在样品中检索到而空白样品中未检索到;b.满足条件1的候选化合物在样品与空白样品中均有检出时,该物质在样品中的响应需比在空白样品中的响应高出至少10倍。实际样品检测时,候选化合物满足2a或2b其一即可。同时满足条件1、2的化合物为可疑候选化合物。

图 1 19种三唑类杀菌剂的化学结构Fig. 1 Chemical structures of the 19 compoundsGroups: 1st group, No. 1; 2nd group, No. 2; 3rd group, No. 3; 4th group, No. 4; 5th group, No. 5; 6th group, Nos. 6-13; 7th group, Nos. 14-15; 8th group, Nos.16-19.

2 结果与讨论

2.1 三唑类杀菌剂的质谱裂解途径

图1为19种三唑类杀菌剂的化学结构式。从结构式可以看出,三唑类杀菌剂都具有1,2,4-三唑官能团和取代苯基等共同特点,1,2,4-三唑官能团中的N原子易于接受质子,因此在正离子模式下检测响应较高,易于形成[M+H]+的准分子离子峰[20],但由于结构上仍然存在较大的差异,导致其质谱裂解途径存在较大差异。因此根据其结构特点,将三唑类杀菌剂分为8类(见图1),每类选择1种典型化合物进行裂解途径研究。8种选定的典型三唑类杀菌剂的质谱信息见表2,二级质谱图见图2,可能的裂解途径见图3。

第一类:三环唑。三环唑的结构与其他三唑类杀菌剂显著不同,其中的1,2,4-三唑官能团与苯并噻唑共用两个原子,形成稳定的共轭体系。其二级质谱图显示:准分子离子[M+H]+为m/z190.043 1,主要二级碎片为m/z163.032 2、m/z136.021 4。三环唑可能的裂解途径见图3[19]。其中准分子离子r0m/z190.043 1(理论m/z190.043 3)首先断裂C-N键得到r1,异构化后得到r2,脱去一分子HCN得到m/z163.032 2(理论m/z163.032 4)的r3。r3经S-N键断裂后得到r4,继而进一步脱去HCN得到m/z136.021 4(理论m/z136.021 5)的r5。

表 2 8种三唑类杀菌剂的高分辨质谱数据Table 2 High resolution mass spectrometry data of eight triazole fungicides

图 2 8种三唑类杀菌剂的二级碎片质谱图Fig. 2 Secondary fragment ion spectra of the eight triazole fungicides

第二类:唑嘧菌胺。唑嘧菌胺的1,2,4-三唑官能团与嘧啶共用两个原子,由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:准分子离子r0m/z276.218 2(理论m/z276.218 3)丢失一分子庚烷得到m/z176.092 8(理论m/z176.093 1)的r1, r0也可经过结构重排后丢失中性分子HCN得到m/z249.208 2(理论m/z249.207 4)的r2,继而丢失一分子庚烷得到m/z149.081 3(理论m/z149.082 2)的r3。

第三类:亚胺唑。亚胺唑结构中含碳-氮双键,且分子中含有硫,其结构与其他三唑类杀菌剂不同,因此将其单独讨论。由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:其中准分子离子r0m/z410.999 7(理论m/z410.999 9)通过丢失1,2,4-三唑中性分子得到m/z341.966 9(理论m/z341.967 2)的r1,继而丢失一分子氯苯得到m/z229.959 1(理论m/z229.959 3)的r2。r1亦可直接丢失C8H5Cl2NS得到m/z125.015 0(理论m/z125.015 3)的r3,继而丢失一分子HCl得到m/z89.038 4(理论m/z89.038 6)的r4。

第四类:氟硅唑。氟硅唑结构中含有硅烷,属于有机硅,与其他三唑类杀菌剂结构有较大区别,因此单独讨论其裂解途径。由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:准分子离子r0m/z316.107 2(理论m/z316.107 6)首先脱去1,2,4-三唑中性分子得到m/z247.074 4(理论m/z247.074 9)的r1, r1可脱去一分子HF得到m/z227.068 2(理论m/z 227.068 7)的r2。r0可去甲基得到m/z300.076 7(理论m/z300.076 3)的r3,继而脱去一分子C3H3N3得到m/z219.043 1(理论m/z219.043 6)的r4, r4脱去一分子C6H5F得到m/z123.005 8(理论m/z123.006 1)的r5。

第五类:戊菌唑。戊菌唑与其他三唑类杀菌剂相比,结构较为特殊,除典型的1,2,4-三唑官能团和卤代苯外无其他取代基,裂解方式较为简单。由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:准分子离子r0m/z284.071 4(理论m/z284.071 6)通过丢失1,2,4-三唑中性分子后可发生异构化,得到两种结构的m/z215.138 5(理论m/z215.038 9)的r1和r2,该结构在易在ESI源轰击下断裂,因此该离子的质谱峰仅在一级质谱图中可见。r1通过丢失丙烯中性分子得到m/z172.991 9(理论m/z172.991 9)的r3; r2丢失一分子丁烯得到m/z158.976 2(理论m/z158.976 3)的r4,继而丢失一分子HCl可得到两种形态的m/z122.999 6(理论m/z122.999 6)的r5和r6。从质谱图中也可以看到较高丰度的m/z89.038 4。

第六类:三唑酮、烯唑醇、烯效唑、多效唑、戊唑醇、环丙唑醇、粉唑醇、四氟醚唑(图1中6～13)。这8种三唑类杀菌剂结构相似,只个别原子、单双键或羟基、酮基等不同,所以将这8种三唑类杀菌剂归为一类进行讨论。以戊唑醇为例,由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:准分子离子r0m/z308.152 1(理论m/z308.152 4)通过丢失1,2,4-三唑中性分子得到m/z239.054 5(理论m/z239.119 7)的碎片离子r1, r1异构化得到r2。r2丢失中性分子丁烷后得m/z181.059 3(理论m/z181.041 5)的r3,继而丢失一分子甲醛得到m/z151.031 0(理论m/z151.030 9)的r4,异构化后丢失一分子乙炔得到m/z125.015 3(理论m/z125.015 3)的r5,继续丢失中性分子HCl后得到m/z89.038 4(理论m/z89.038 6)的r6。

第七类:腈菌唑、腈苯唑(图1中14～15)。这两种杀菌剂主链上含有腈基,此种结构与其他三唑类杀菌剂具有明显区别,将这两种杀菌剂单独讨论。以腈菌唑为例[19],由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:其中准分子离子r0m/z289.121 2(理论m/z289.121 5)首先丢失1,2,4-三唑中性分子后得到m/z220.088 6(理论m/z220.088 8)的r1,继而丢失中性分子丙烯得到m/z178.041 8(理论m/z178.041 8)的r2, r2丢失一分子HCN得到m/z151.030 7(理论m/z151.030 9)的r3,继续丢失一分子乙炔得到m/z125.015 2(理论m/z125.015 3)的r4,该结构丢失中性分子氯化氢得到m/z89.038 4(理论m/z89.038 6)的r5。r1还可分别通过丢失中性分子丁烯得到m/z164.026 2(理论m/z164.026 2)的r6,丢失乙烯得到m/z192.057 14(理论m/z192.057 5)的r7。

第八类:氟环唑、糠菌唑、苯醚甲环唑、丙环唑(图1中16～19)。这4种三唑类杀菌剂结构中均含有环氧烷结构,裂解方式较为特殊,因此将这4种三唑类杀菌剂作为同一类进行讨论。以糠菌唑为例,由二级质谱图推测其可能的裂解途径如下:准分子离子r0m/z375.961 2(理论m/z375.961 4)首先丢失1,2,4-三唑中性分子后经过分子内异构化形成更稳定的m/z306.928 9(理论m/z306.928 7)的r1, r1脱去中性分子溴化氢得到m/z227.002 7(理论m/z227.002 5)的r2, r2打开含氧六元环结构形成r3,丢失中性分子CO形成m/z199.006 9(理论m/z199.007 6)的r4, r4丢失中性分子丙炔形成m/z158.976 3(理论m/z158.976 3)的r5, r5丢失中性分子氯化氢得到m/z122.999 6(理论m/z122.999 6)的r6或r7; r4还可丢失中性分子丁炔形成m/z144.960 6(理论m/z144.960 6)的r8。

2.2 三唑类杀菌剂质谱裂解规律

根据上述讨论的三唑类杀菌剂裂解途径,大部分三唑类杀菌剂的三唑环以取代基的形式与主链相连,同时结构中一般含有取代苯。因此在ESI源条件下,解离过程是首先丢失三唑环(产生m/z70.034 0 的特征碎片或者产生m/z69.032 7 的特征丢失),然后丢失中性小分子,以小分子烯烃居多。当化合物结构中存在一元卤素取代时,会出现m/z125.015 3、m/z89.038 6 的特征碎片,而当结构中存在二元卤素取代苯结构时,会出现m/z122.999 6、m/z89.038 6 的特征碎片离子。以戊唑醇为代表的三唑类杀菌剂与以腈菌唑为代表的三唑类杀菌剂的差别仅为:前者是以羟基取代而后者是以腈基取代,因此在断裂过程中此部分丢失的中性小分子不同,其他解离过程基本类似。而三环唑、唑嘧菌胺这类可产生共轭体系的化合物在解离过程中会打开三唑环,继而丢失中性分子HCN,因此在筛选时可以设置单独的筛选条件如:设置特征碎片离子m/z163.032 4、m/z136.021 5 和中性丢失HCN来专门筛选三环唑;设置特征碎片离子m/z249.207 4、m/z176.093 1、m/z149.082 2 和中性丢失HCN、C7H16来专门筛选唑嘧菌胺。

2.3 裂解规律验证

应用上述裂解规律,将未进行裂解途径分析的11种三唑类杀菌剂标准品进行筛选方法的验证。使用MSE扫描模式对11种标准品(粉唑醇、氟环唑、三唑酮、四氟醚唑、丙环唑、腈苯唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、烯效唑、烯唑醇、多效唑)进行二级碎片离子全扫描,并使用1.5节中的筛选方法进行提取,结果如表3所示,所有标准品均可用该方法筛选出来,表明本研究中得到的三唑类杀菌剂的裂解规律可作为非靶向筛查的依据。

表 3 11种三唑类杀菌剂标准品的筛选结果Table 3 Screening results of 11 triazole fungicide standards

表 4 11种三唑类杀菌剂的基质效应Table 4 Matrix effect of 11 triazole fungicides

2.4 基质效应考察

基质效应研究采用基质配制的标准溶液与纯标准溶液的峰面积之比表示。11种三唑类杀菌剂的基质效应见表4。结果表明,这11种杀菌剂均为基质抑制,特别是氟环唑、三唑酮和烯效唑。为最大限度降低基质效应干扰,本研究采用基质匹配法进行分析。以空白样品的提取液为标准溶液的稀释溶液,可使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化环境,从而降低基质效应。

2.5 实际样品测定

图 4 西红柿样品和烯唑醇标准溶液的色谱图及二级碎片质谱图Fig. 4 Chromatograms and secondary fragment ion spectra of diniconazole in a tomato sample and reference standard solutiona. Base peak ion (BPI) chromatogram of a tomato sample; the small picture: candidate compound [M+H]+m/z 326.0820; b. secondary fragment ion spectrum of diniconazole in a tomato sample; c. BPI chromatogram of diniconazole reference standard; d. secondary fragment ion spectrum of diniconazole (10 mg/L standard).

使用MSE模式对北京市售16份西红柿样品进行二级碎片离子全扫描,并使用1.5节中的筛选方法进行提取,在1份西红柿样品中检测到标识性碎片离子m/z70.034 0、m/z89.038 6、m/z122.999 6 和中性丢失碎片m/z27.994 9(CO),m/z35.976 7(HCl),m/z56.062 6(C4H8),准分子离子为m/z326.082 0 的可疑化合物。根据标识性碎片离子m/z70.034 0 推测该化合物可能是一种三唑类杀菌剂,母离子具有9∶6∶1的同位素峰表明该化合物具有二氯取代,再由中性丢失C4H8可推测结构中可能含有异丁基,丢失CO可推测结构中可能含有羟基或羰基取代。根据表3,我们推测样品中可能含有烯唑醇。进一步采用标准品进行验证。烯唑醇的标准品色谱图为图4c,保留时间为4.74 min),质谱图为图4d(母离子为 326.082 0,子离子为 158.976 1 和 70.039 5),而在实际样品中(见图4a和4b),保留时间为4.76 min,母离子和子离子分别为 326.082 0、158.976 2 和 70.039 7,这和标准品的保留时间和质谱信息一致,由此我们确认该西红柿样品中含有烯唑醇,由此也验证了本文中推测的三唑类杀菌剂质谱裂解规律。