激光削除1/3周透明带对冻融单囊胚移植临床结局的影响

周娜汝，金仁桃，卢芳汀，许波，李婧瑶，王玉瑞，祝心怡，童先宏

(中国科学技术大学附属第一医院生殖与遗传分院，合肥 230001)

随着辅助生殖技术(ART)的日渐成熟和广泛应用，医源性多胎妊娠已成为ART治疗不孕症的一个严重并发症，所以在保证成功率的同时能有效降低多胎率，行单囊胚移植成为了不孕患者的最理想选择。

囊胚从透明带中顺利的孵出是胚胎着床所必需，有研究报道体外培养时间延长、胚胎冷冻和解冻等体外操作会导致透明带硬化，使得囊胚不能从透明带中孵出，最终无法顺利完成着床[1-2]，而辅助孵化技术的应用可增加胚胎从透明带顺利孵出的机会[3-4]，提高临床妊娠率。但也有研究报道认为辅助孵化并不能增加临床妊娠率。这种研究结果的不一致性一方面在于研究背景不同，另一方面的共同特点是上述研究中的辅助孵化技术均采用了激光透明带打孔或削薄[5-9]。激光透明带打孔或削薄可能会造成囊胚孵出时嵌顿或透明带开口不完全造成囊胚单卵双胎或着床困难[10-12]。本文旨在研究激光削除1/3周透明带对冻融单囊胚移植临床结局的影响，为激光辅助孵化在临床中的应用提供参考依据。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2018年5月至2019年3月在我院生殖中心行冻融单囊胚移植的688例周期患者的临床资料。其中经355对夫妇(周期)知情同意后，对解冻后囊胚行激光削除1/3周透明带辅助孵化后移植(LAH组)，其余333例周期患者囊胚解冻后未行激光辅助孵化移植(NLAH组)。纳入标准：(1)移植日子宫内膜的厚度≥7 mm；(2)第5 天囊胚级别3 CB或3 BC及以上。排除标准：(1)反复种植失败；(2)复发性流产病史；(3)输卵管积水；(4)子宫腺肌症、子宫内膜异位症等疾病；(5)移植日子宫内膜<7 mm。

二、研究方法

1.促排卵方案和IVF培养：采用本中心常规长方案[13]方法促排卵，取卵、IVF及胚胎培养等按常规方案进行，第3天发育到6细胞及以上的Ⅰ级或Ⅱ级优质胚胎，知情患者后，选取1～2枚胚胎移植或冷冻，后将剩余胚胎行囊胚培养，待养成囊胚后进行玻璃化冷冻保存[14]。

2.囊胚的分级：根据Gardner胚胎等级评分标准[15]，按照囊胚扩张程度和孵出情况、内细胞团、滋养外胚层细胞三个主要方面进行评分，根据囊腔的扩张孵化将囊胚分为1～6 期；根据内细胞团和滋养外胚层细胞的细胞数及细胞间紧密程度将内细胞团和滋养外胚层分为3级，即A 级、B 级、C 级。对分级在1期、2期或CC以上的第5天或者第6天囊胚行玻璃化冷冻。3 BB及以上定义为优质囊胚。如有多个囊胚可供移植，一般选择3期及以上囊胚进行移植。

3.囊胚冷冻：根据上述囊胚评分标准，适宜冷冻的囊胚逐个放置在囊胚液滴内，囊胚冷冻前需要先行激光辅助皱缩，选择远离内细胞团的滋养外胚层细胞连接处进行，皱缩孔径8～12 μm，放回37℃ COOK三气(6% CO2、5% O2、89% N2)培养箱内8～10 min，待其完全皱缩。采用玻璃化冷冻试剂盒(Kitazato，日本)对胚胎或囊胚进行玻璃化冷冻。冷冻步骤：将囊胚在平衡液中放置8～10 min，后立即转移到玻璃化冷冻液中，并在1.5 min之内迅速装载到冷冻载杆并投放到液氮中，装好套管，保存于液氮中。

4.囊胚解冻：采用玻璃化解冻试剂盒(Kitazato，日本)对胚胎或囊胚进行玻璃化解冻。在解冻当日，将囊胚解冻液从冰箱取出，其中解冻液(TS)放置在37℃培养箱复温15 min，稀释液(DS)、洗涤液(WS1、WS2)常温复温。复温后，将取0.5 ml TS液放置胚胎解冻皿-单孔中，放置37℃培养箱备用，依次取DS、WS1、WS2各0.3 ml置于胚胎解冻皿-三孔中常温放置备用。解冻时，将载杆从液氮中取出，迅速甩动载杆，促使表面液氮挥发，再迅速置于37℃ TS液停留1 min，DS液停留3 min，WS1液停留5 min，WS2液停留1 min，均在室温下操作。

5.透明带削除辅助孵化：在解冻期间，当囊胚从DS液移至WS1液时，这时囊胚尚在邹缩状态，采用RI激光打孔仪。激光靶点定为到透明带位置(远离囊胚细胞团)，将激光脉冲持续时间调到400 μsec，沿着透明带安全区域连续削掉1/3周长的透明带(图1A)，待WS1液平衡5 min后，将孵化后的囊胚转移到WS2液，停留1 min，后将囊胚置于COOK三气(6% CO2、5% O2、89% N2)培养箱继续培养2 h等待移植，移植前于显微镜下观察囊胚扩张情况并判断其是否存活。存活囊胚在B超引导下进行移植。

A：冻融囊胚激光削除1/3周透明带(箭头示激光削除1/3周透明带处)；B：未行激光削除冻融囊胚图1 冻融囊胚透明带示意图(×45)

6.内膜准备、黄体支持和妊娠判断：内膜准备采用自然周期或人工周期方案。自然周期方案是排卵后第5天移植单囊胚；人工周期方案是用戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)4～8 mg，持续12～14 d左右，内膜厚度达到7 mm及以上，再联合使用黄体酮(浙江仙琚制药)肌肉注射及地屈孕酮片(达芙通，雅培，荷兰)口服，5 d后行单囊胚移植。胚胎移植12 d之后，血HCG≥50 U/L为阳性；HCG阳性者于移植后4周行超声检查，子宫腔内见孕囊和原始心管搏动为临床妊娠；患者所选移植囊胚数均是一枚，一个孕囊中看到两个胎心或是孕囊数超过移植的胚胎数为单卵双胎；妊娠12周之内发生的流产为早期流产。

7.观察指标：优质囊胚率=优质囊胚数/复苏囊胚总数×100%；囊胚存活率=存活囊胚数/复苏囊胚总数×100%；HCG阳性率=HCG阳性周期数/冻融囊胚移植周期数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/冻融囊胚移植周期数×100%；种植率=孕囊数/冻融囊胚移植数×100%；单卵双胎率=单卵双胎周期数/临床妊娠周期数×100%；早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学处理

结 果

一、两组患者的一般资料

NLAH组患者年龄为25～45岁，平均年龄为(31.73±4.81)岁；LAH组患者年龄为26～45岁，平均年龄为(32.16±5.09)岁。两组患者间年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、获卵数、内膜厚度、不孕原因、优质囊胚率、囊胚存活率比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

二、两组患者的临床结局比较

统计结果显示，两组患者的单卵双胎率、早期流产率均无显著性差异(P>0.05)；而LAH组的HCG阳性率、临床妊娠率和种植率均显著高于NLAH组(P<0.05)(表2)。

表1 两组患者一般资料比较[(-±s)，%]

表2 冻融单囊胚移植后妊娠结局的比较(%)

注：与NLAH组比较，*P<0.05

讨 论

近几年，随着二胎的放开、高龄患者增加，在辅助生殖技术领域如何选择胚胎进行移植，以降低医源性多胎、提高妊娠率一直存有争议。2018年中华医学会生殖医学分会关于移植胚胎数的专家共识[16]中指出，对于预后良好的35～37岁女性，建议选择性单胚胎移植，以降低多胎妊娠率和母婴并发症。而囊胚与卵裂胚相比，延长了体外培养时间，能在一定程度上对携带有遗传缺陷或发育潜能低的胚胎进行淘汰，一般能发育到囊胚的胚胎具有更高的发育潜能，能提高临床的种植率并获得良好的妊娠结局[17]。此外，在临床上，卵裂期胚胎形态学评分存在局限性，形态学评分为次级的胚胎往往也能发育到优质囊胚[18]。随着ART不断发展，囊胚培养技术也在不断改进和完善，这意味着囊胚培养能明显提高临床妊娠率和种植率。因此，行单囊胚移植成为了优选方案。

透明带可以维持卵母细胞和早期胚胎结构的完整性，但当胚胎发育到囊胚期，如果不能从透明带中顺利孵出，则会导致胚胎着床失败。有研究表明，冻融胚胎后的透明带结构发生变化，会导致胚胎透明带变硬，增大了胚胎从透明带中孵出的阻力[8]。因此，冻融囊胚移植前行辅助孵化逐渐成为常规操作。但由于机械法对操作者的技术要求很高，化学法对胚胎发育存在不安全性隐患，所以国内普遍使用激光透明带打孔或削薄辅助孵化。

本研究中选择激光削除囊胚透明带1/3周长，临床妊娠率、种植率分别为54.93%、56.06%；而囊胚未行激光削除透明带周长的1/3，临床妊娠率、种植率分别为为44.44%、45.35%，结果表明激光削除囊胚透明带周长的1/3显著提高移植成功率(P<0.05)。虽然不同的胚胎学者对囊胚的评分有一定主观性，但两组患者移植的优势囊胚率不存在显著性差异，而且所移植囊胚均包含评分较低的囊胚。激光削除囊胚透明带1/3周长组在HCG阳性率、临床妊娠率和种植率都获得了显著的提高，但单卵双胎率和早期流产率并无显著性差异，这同Wan等[19]的研究结果相似。

激光辅助孵化虽然可以提高妊娠率和种植率，但可能也会增加单卵双胎，单卵双胎更易引起胎儿死亡和新生儿出生缺陷，增加母婴风险[20]。但是本研究中并没有提高单卵双胎率，可能是因为本研究中激光削除透明带周长的1/3、囊胚更易从透明带中顺利孵出的缘故。如果削除透明带周长较短，囊胚可能被卡在其中，导致囊胚不能成功孵出或内细胞团分裂形成两个独立的胚胎，易发生单卵双胎的概率。因此推断，激光削除透明带周长1/3时，可能并不会增加单卵双胎的风险。另外，国内近期报道了激光辅助孵化完全去除透明带后也取得了较好的临床结局[21]，但目前国内对激光辅助孵化完全去除囊胚透明带的临床结局影响尚缺乏大样本数据的支持。国外也有研究表明激光辅助孵化完全去除透明带能够提高移植成功率[22]，但对流产率的影响并没有提及。

综上所述，冻融单囊胚移植前行激光削除1/3周透明带辅助孵化技术提高了临床妊娠率，但不增加单卵双胎率和早期流产率。所以冻融单囊胚移植前行激光削除1/3周透明带，可以作为临床上提高囊胚移植成功率的一个有效方法。但激光辅助孵化是否对活产率和新生儿的影响还需要收集更多的样本，进行大力研究，以进一步了解激光辅助孵化与临床结局的关系，更好的服务于患者。