鸡蛋和胎粪禽白血病病毒p27抗原检测试验

童洪生

福建省建宁县动物疫病预防控制中心，福建建宁354500

禽白血病（AL）是一种免疫抑制性疾病，禽白血病病毒（ALV）可以通过垂直和水平2 种方式传播感染鸡群，给养鸡业造成了巨大的经济损失。迄今为止，尚无有效预防和治疗措施，对鸡群的净化是控制AL 的唯一有效途径[1-2]。开展AL 的净化，主要是通过对种鸡群进行ALV 检测，淘汰带毒的种鸡，经过不断地检测和淘汰，达到纯化种群的目的[3]。为明晰鸡蛋和胎粪ALV p27 抗原的变化规律，选择某鸡场2 个品系的鸡群，分别对鸡蛋和雏鸡胎粪开展p27 抗原检测试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1）种鸡与鸡蛋。选择某品种鸡的2 个品系为试验群体，分别为快羽系和慢羽系。43 周龄种鸡纯繁前，对1 492 只母鸡，连续9 d 采集鸡蛋，每3 d 捡1 次。超过3 枚鸡蛋的保留3 枚，不到3 枚鸡蛋的母鸡以实际采集鸡蛋数为准，共采集种蛋4 316 枚。不同品系采集种蛋数见表1。

表1 不同品系种蛋采样统计

公鸡使用泄殖腔棉拭子，开展p27 抗原检测，其中快羽系检测公鸡153 只，慢羽系共检测公鸡148 只。

2）雏鸡与胎粪。保留p27 抗原检测为阴性的公鸡和母鸡，按公母1∶5[3]组建家系。每3～4 d 人工输精1 次，每15 d 入孵1 批种蛋。根据生产的安排，快羽系入孵1 批，慢羽系入孵3 批。孵化条件为37.5 ℃，湿度65%[4]。种蛋落盘时按家系分组，每1个全同胞家系的种蛋放在1 个出雏筐内。雏鸡出生时佩戴翅号，登记家系编号。每戴完1 个家系的翅号，立即用消毒液洗手，不同批次入孵的种蛋和雏鸡数见表2。

表2 不同批次不同品系检测雏鸡数 只

3）试剂。①禽白血病病毒p27 抗原ELISA 检测试剂盒：IDEXX 公司。②酒精棉：75%酒精浸泡。

4）主要仪器。酶标仪（Thermo）、洗板机（Biorad、Thermo）、100 μL 单道移液器（Eppendorf）、300 μL八道移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1）蛋清的采集与处理。酒精棉擦拭蛋壳表面后用镊子轻轻将蛋壳敲破，用移液器在蛋壳破碎处吸取蛋清1 mL，转入到1.5 mL 离心管内，冻融2～3次[5]用于下一步试验。

2）泄殖腔棉拭子的采样与处理。用酒精棉擦拭公鸡肛门外侧，棉签伸入公鸡肛门内2 cm 处[6]，旋转1 周后取出，放入预先加入0.5 mL 稀释液离心管内，静置2 h，取出棉签。样品冻融1 次后可用于下一步试验。

3）胎粪的采集与处理。用1.5 mL 离心管，提前加入0.5 mL 稀释液。雏鸡出生12 h 内用手抓住雏鸡，轻压雏鸡腹部，将胎粪挤入离心管内，来回颠倒摇匀。为了快速冻融胎粪样品以释放p27 抗原，将样品迅速放入液氮中快速冷冻，5 min 后取出，室温内溶解回温，静置1 h 准备下一步试验[7]。

4）ELISA 检测。按照IDEXX 禽白血病病毒p27抗原ELISA 检测试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 种蛋p27 抗原检测结果

1）不同品系比较。本试验检测了快羽系760 只鸡，共2 202 枚鸡蛋，有43 只鸡检测到阳性鸡蛋，阳性比例为5.7%，其中6 只鸡3 枚鸡蛋都为阳性，4只鸡2 枚鸡蛋显示阳性，33 只鸡有1 枚鸡蛋检测结果为阳性。本试验检测了慢羽系732 只鸡，共2 114枚鸡蛋，有47 只鸡检测到阳性鸡蛋，阳性比例为6.4%，其中7 只鸡3 枚鸡蛋为阳性，10 只鸡2 枚鸡蛋为阳性，30 只鸡有1 枚鸡蛋为阳性。按照疾病净化标准，只要有1 枚鸡蛋p27 抗原结果检测为阳性，则认为该鸡为ALV 携带者，判为阳性鸡。检测结果显示慢羽系阳性比例略高于快羽系。

2）不同重复鸡蛋数比较。表3 给出了不同重复鸡蛋数p27 抗原检测结果。当重复鸡蛋数为3 枚时，在1 372 只母鸡中有13 只鸡的3 枚蛋为阳性，12 只鸡的2 枚蛋为阳性，58 只鸡的1 枚蛋检测结果为阳性。检测鸡蛋数为3 枚时，1 372 只鸡有83只为阳性鸡，比例6.0%。当检测鸡蛋数为2 枚时，80只鸡有4 只为阳性鸡，比例5.0%。当检测鸡蛋数为1 枚时，40 只鸡仅1 只鸡检测到阳性鸡蛋，阳性比例2.5%。

以上结果证明，即使检测3 枚重复鸡蛋，并不一定3 枚蛋都为阳性，更大比例（69.9%）是仅检测到1 枚阳性鸡蛋。随着检测重复鸡蛋数的增加，检出阳性鸡的比例数也相应增加。

2.2 雏鸡胎粪p27 抗原检测结果

1）快羽系。结合实际生产的安排，本试验快羽系仅繁育1 批，共检测了275 个全同胞家系，2 560份雏鸡胎粪样品。如果按照个体统计，2 560 份检测样品中共检测到37 个阳性个体，阳性比例仅1.45%。而如果按照家系统计（表4），则30 个家系，也就是仍然有30 只母鸡的后代出现了阳性鸡，比例达10.9%。

2）慢羽系。本试验慢羽系共繁育3 批，3 个批次检测的家系数有所不同，分别检测了224、241 和194 个家系的后代雏鸡。如果按照个体统计（表5），第1 批检测雏鸡2 142 只，阳性个体104 只，阳性比例4.9%；第2 批检测雏鸡2 227 只，阳性个体125 只，阳性比例5.6%；第3 批检测雏鸡1 454 只，阳性鸡78 只，阳性比例为5.4%。3 个批次的平均阳性率为5.3%。

表3 不同重复鸡蛋数检测结果

表4 快羽系按家系统计检测结果

表5 慢羽系不同批次按个体统计阳性比例

按照家系统计（表6），3 批繁育中，第1 批的224 个家系中有72 个检出阳性雏鸡，阳性家系比例32.1%；第2 批的241 个家系中有83 个检出了阳性雏鸡，阳性家系比例34.4%；第3 批的194 个家系中有56 个检出了阳性雏鸡，阳性家系比例28.9%。3次平均阳性家系比例为32.0%。出现1 个阳性的家系占全部阳性家系的67.3%，出现2 个阳性的家系占24.6%；少数家系会出现3 个或4 个，甚至5 个阳性雏鸡。

由慢羽系同一个家系在不同批次之间的比较结果可以看出（表7）：3 批纯繁都有雏鸡的家系有173 个，其中13 个家系在3 批中都检出了阳性雏鸡，占7.5%；有37 个家系在2 批中检出了阳性雏鸡，占21.4%；68 个家系只在1 批中检出了阳性雏鸡，比例39.3%，另外55 个家系（31.8%）在3 批纯繁检测中都未检出阳性雏鸡。仅2 批纯繁有雏鸡后代的家系有64 个，4 个家系2 次都检出了阳性雏鸡，18 个家系仅1 次检出阳性雏鸡。检出阳性雏鸡家系比例合计34.4%，低于3 次都有雏鸡家系中检出阳性雏鸡家系的比例（68.2%）。仅1 批纯繁有雏鸡的家系有45 个，阳性家系比例17.8%，检出率远低于2 批有雏鸡和3 批都有雏鸡的情况。

本试验还对同一批同一家系检出阳性雏鸡只数以及重复性进行了比较（表8）。如果在某一批次雏鸡中检出阳性鸡只数≥3 只的家系，则93.4%的家系在2 批或者3 批纯繁中都会检出阳性雏鸡。而如果某一批次中检出2 只阳性雏鸡的家系，则45%的家系会在2 批或3 批纯繁中都检出阳性雏鸡。如果检出阳性鸡只数只有1 只的家系，则仅有23.7%的家系会2 次及以上检出阳性雏鸡。

表6 慢羽系不同批次按家系统计阳性比例

表7 慢羽系同一家系不同批次间比较

表8 同一批中检出阳性鸡只数与重复性的比较

3 讨论

ALV 可以通过垂直和水平2 种方式传播感染鸡群，而且是一种免疫抑制性疾病，对养鸡业造成了巨大的经济损失[8-10]。迄今为止，尚无有效预防和治疗措施，因此，对鸡群的净化是控制AL 的唯一有效途径。主要是通过对种鸡群进行ALV 检测，淘汰带毒的种鸡，通过不断的净化达到纯化种群的目的[8]。

本试验为明晰鸡蛋和胎粪ALV p27 抗原的变化规律，选择了某鸡场2 个品系的鸡群，分别对鸡蛋和雏鸡胎粪开展了p27 抗原检测试验，共检测了2 个品系1 492 只母鸡的4 316 枚种蛋和8 383 只雏鸡胎粪。得出如下结论：

1）鸡蛋和胎粪检测结果显示，慢羽系AL 感染阳性率均高于快羽系。

2）ALV 感染鸡只排毒呈间歇性，检测重复数越多，检出的阳性率越高，检测的准确性和可靠性越高。为了提高检测效率，对种蛋需尽可能采集2～3个样品，雏鸡出生时需要全部检测，以加快净化速度[9]。

3）纯繁之前对种蛋进行ALV 检测，阴性鸡留种纯繁，并不能保证雏鸡出生时全部为阴性，群体仍然存在低比例的阳性雏鸡。为有效净化AL，需多次重复检测，及时淘汰阳性雏鸡及其父母代，在控制ALV 垂直传播的同时，也尽量减少其水平传播机率，逐步完成AL 的净化[10-11]。