褪黑激素对精神分裂症小鼠行为及氧化应激的影响

潘小平，李国成

（1. 广西壮族自治区百色市第二人民医院，广西 百色 533000； 2. 广西壮族自治区脑科医院，广西 柳州 545505）

精神分裂症是一种复杂的神经精神疾病，与多巴胺、胆碱能和谷氨酸能等神经递质系统的功能障碍有关，导致大脑生化和临床表型的改变[1]。大量研究表明，抗氧化防御系统的崩溃与精神分裂症密切相关[2]。目前，常用N－甲基－D－天冬氨酸谷氨酸受体（NMDA－R）拮抗剂如地卓西平（MK－801）、氯胺酮和苯环利定的药理学模型对精神分裂症进行动物机制研究[3]。重复使用MK－801 与自主活动增加、社交退缩和记忆丧失等一系列行为改变相关，曾报道与氧化状态的变化有关[4]。MK－801的使用与大脑所有区域谷胱甘肽（GSH）／脂质过氧化和髓过氧化物酶活性的增加相关[5]。多巴胺拮抗剂如利培酮能有效逆转精神分裂症患者阳性症状，但无法改善其认知障碍、社交退缩及与代谢紊乱相关的预期寿命下降[6]。非典型抗精神病药物可治疗精神分裂症的阳性和阴性症状，但无明确证据表明其比利培酮更有效或耐受性更好[7]。研究表明，褪黑素参与了精神分裂症的发病过程[8]，精神分裂症、昼夜节律障碍和精神分裂症患者褪黑激素水平的关系[9]。褪黑素也被用于控制精神分裂症相关的睡眠障碍和药物相关的迟发性运动障碍，但其治疗精神分裂症的作用机制尚不清楚[10]。本研究中通过腹腔注射MK－801 诱导小鼠精神分裂症模型，并给予褪黑素进行干预，以探讨褪黑激素通过对大脑氧化应激的影响，发挥减轻精神分裂症模型小鼠行为异常的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：Sunrise 型全自动酶标仪（瑞士Tecan 公司）；旷场实验设备（北京金盛恒星医疗器械公司）；Morris 水迷宫装置及DigBehv 动物行为分析系统（上海吉量软件科技有限公司）。

试药：褪黑素和地卓西平马来酸盐（MK－801，美国Sigma 公司，批号分别为M5250 和1001799365）；利培酮（北京天衡药物研究院南阳天衡制药厂，批号为06－140602）；丙二醛（MDA）试剂盒（批号为A020－2－2），谷胱甘肽（GSH）试剂盒（批号为A005－1－2），均购自南京建成生物工程研究所；一氧化氮（NO）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号为ml076941）。

动物：40 只C57BL／6 小鼠，河北医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（冀）2012－0002。

1.2 方法

动物模型制备、分组与给药：选择40 只体质量在25 ～30 g 的雄性C57BL／6 小鼠，于22 ～24 ℃、相对湿度为40% ～70%、昼夜循环（12 h／12 h）的SPF 环境中自由进食和饮水，适应性喂养1 周后进行试验。按随机数字表法将小鼠均分为对照组、模型组、利培酮组和褪黑素组，各10 只。模型组、利培酮组和褪黑素组小鼠均给予腹腔注射MK－801（0.1 mg／kg），建模成功标准参考SAMS－DODD 刻板行为评分标准[11]；对照组腹腔注射生理盐水（0.1 mg／kg），选择小鼠左或右（每日交叉）下侧腹部进行注射，连续注射直至试验结束。第15 天开始，利培酮组小鼠灌胃给予利培酮（0.025 mg／kg），褪黑素组小鼠灌胃给予褪黑素（5 mg／kg）[12]，对照组和模型组小鼠灌胃给予等量生理盐水，连续14 d 后进行相关试验。

社会交往测试：第21 天，将小鼠置大小为100 cm×100 cm ×40 cm 的社交测试箱内进行适应，每天适应5 min，第28 天给药结束后将模型组、利培酮组和褪黑素组小鼠与对照组小鼠进行两两配对，通过测试箱顶部安装的摄像头对小鼠的社交行为进行记录并分析。测试时间为7 min，社交行为分为非攻击性行为（与同伴嗅闻、尾随、社交性玩耍、理毛）和攻击性行为（与同伴踢打、摔跤或打架），计算社交时间与测试时间的比值（%）。

旷场测试：所有小鼠做完社会交往测试后在安静的房间内将小鼠放入旷场实验设备的中心方格内，记录小鼠在10 min 内穿越格子的次数。

Morris 水迷宫测试：第1 ～14 天，小鼠在Morris 水迷宫内自由游泳以适应环境，第21 天开始对小鼠进行连续7 d 的水迷宫训练，在末次给药后进行水迷宫测试。

氧化应激指标测定：所有小鼠在做完行为测试后第2 天脊髓脱臼处死，分离脑组织，用玻璃匀浆器将脑组织在冰冷的磷酸盐缓冲液中匀浆（1 ∶10，W ／ V），在5 000 r／min（4 ℃）下离心15 min，取上清液，根据试剂盒说明书分别检测MDA，GSH，NO 的含量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0 统计学软件分析。计量资料以均数±标准差（）表示，行单因素方差分析，组间两两比较用SNK－q检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠社交时间和跨格总数

与对照组比较，模型组、利培酮组和褪黑素组小鼠社交时间减少，跨格总数增加（P ＜0.05）；与模型组比较，利培酮组和褪黑素组小鼠社交时间增加，跨格总数降低（P ＜0.05）；利培酮组和褪黑素组小鼠社交时间和跨格总数差异不显著（P ＞0.05）。结果见表1。

表1 各组小鼠社交时间和跨格总数比较（±s，n ＝10）

表1 各组小鼠社交时间和跨格总数比较（±s，n ＝10）

注：与对照组相比，aP ＜0.05；与模型组相比，bP ＜0.05。下表同。

组别对照组模型组利培酮组褪黑素组社交时间（s）62.42±5.61 14.98±2.13a 46.64 ±4.14ab 44.15 ±2.24ab跨格总数（次）232.50±28.64 348.27±19.20a 299.26 ±16.34ab 302.39 ±41.28ab

2.2 小鼠学习记忆能力

与对照组比较，模型组、利培酮组和褪黑素组小鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数显著减少（P ＜0.05）；与模型组相比，利培酮组和褪黑素组小鼠逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数显著增多（P ＜0.05）；利培酮组和褪黑素组小鼠逃避潜伏期和穿越平台次数差异不显著（P ＞0.05）。详见表2。

表2 各组小鼠学习记忆能力比较（±s，n ＝10）

表2 各组小鼠学习记忆能力比较（±s，n ＝10）

组别对照组模型组利培酮组褪黑素组逃避潜伏期（s）21.20±3.14 47.19±5.30a 34.46±4.08ab 37.48±6.50ab穿越平台次数（次）5.31 ±0.65 2.07±0.54a 3.86±1.23ab 4.01±0.64ab

2.3 小鼠脑组织中MDA，GSH，NO 含量

与对照组比较，模型组、利培酮组和褪黑素组小鼠脑组织中MDA 和NO 含量显著升高，GSH 含量显著降低（P ＜0.05）；与模型组相比，利培酮组和褪黑素组小鼠脑组织中MDA 和NO 含量显著降低，GSH 含量显著增高（P ＜0.05）；利培酮组和褪黑素组小鼠脑组织中MDA，GSH，NO 含量差异不显著（P ＞0.05）。详见表3。

表3 各组小鼠脑组织中MDA，GSH，NO 含量比较（X±s，n ＝10）

3 讨论

外源性褪黑激素的作用已被广泛研究。患者白天服用褪黑素可促进睡眠，并在海马区形成类似睡眠的大脑活动模型；外源性褪黑激素在啮齿类动物中有抗惊厥、抗焦虑、抗抑郁、促进记忆的作用[12]。褪黑素对逆转MK－801 诱导的小鼠精神分裂症相关行为和生化变化有好处[12]，明确了褪黑激素作为人类精神分裂症治疗辅助手段的有效性，但关于其作为唯一药物的潜在临床前信息仍然匮乏。MK－801 通过NMDA－R 的拮抗作用诱导精神分裂症样症状，通过抑制γ－氨基丁酸（GABA）能神经元，导致谷氨酸和多巴胺的可用性增加，导致激发（过度运动）[13]。本研究中以重复给予NMDA－R 受体拮抗剂MK－801 建立了精神分裂症动物模型。利培酮是一种多巴胺（D2）和5－羟色胺（5HT）2A受体拮抗剂，由于对5－HT2A和α1－肾上腺素能受体的强效拮抗作用，具有抵抗MK－801 诱导的过度运动能力，还可通过增加海马乙酰胆碱的释放、内侧前额叶皮层中乙酰胆碱或多巴胺浓度，以抵消MK－801 诱导的记忆丧失，逆转与MK－801 给药相关的社交或工作记忆缺陷[14]。褪黑素具有中枢抑制作用（减少运动和梳理毛发），对运动的影响的可能原因是其在神经递质系统中恢复同步的能力，这可能会导致兴奋性和抑制性神经递质活动之间恢复平衡[15]。褪黑激素对大脑具有抗兴奋作用，其抗惊厥作用与褪黑激素促进GABA 的传递有关，增强GABA 能直接抵消MK－801 对谷氨酸和多巴胺的影响[16]。褪黑激素的记忆增强作用是通过对神经细胞黏附分子（NCAM）的影响，导致重塑突触连接的能力增强而实现的[17]。本研究结果显示，褪黑素具有中枢抑制作用，可减少开放领域的行为和增加社交能力，改善小鼠的学习记忆能力，抑制小鼠脑部的氧化应激状况。

精神分裂症中存在氧化损伤，氧化损伤也与预后有关，MK－801 对大脑抗氧化状态的影响与PAWETCZYK 等[18]的研究结果一致。MK－801 给药导致抗氧化活性的改变，GSH 减少，NO 和MDA（脂质过氧化指数）水平增加[19]。给予利培酮能逆转氯胺酮诱导的氧化应激，褪黑素能增加大脑GSH 活性，并降低脑MDA 和NO 水平[20]。褪黑素的抗氧化作用能增加GSH过氧化物酶和还原酶的活性，刺激抗氧化酶清除自由基和中和活性氧／氮物种。褪黑素对脂质过氧化的影响归因于其中和引发脂质过氧化的毒性反应物（LOOH）的能力。褪黑素还对NO 有亲和力，其易于渗透到亚细胞区室中，诱导内皮细胞损伤和凋亡[21]。与标准抗精神病药利培酮相比，褪黑素也具有一定的抗氧化作用，提示其有助于改善与精神分裂症发病相关的氧化应激。

综上所述，褪黑素能逆转MK－801 引起的行为变化，其效果与利培酮相当，其作用可能与阻断大脑氧化应激反应有关，可能成为治疗精神分裂症的药物和／或辅助治疗药物，但仍需更多的研究来证明其可作为精神分裂症治疗的潜在药物。