miR-149和miR-196a2在亚洲人群中与脑卒中发病关系的Meta分析

杨锡彤，徐弘扬，马 蓉，王光明*

（1.大理大学第一附属医院基因检测中心，云南大理 671000；2.大理大学临床医学院，云南大理 671000）

脑卒中（stroke）是一种突发性的脑血液循环障碍性疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高以及复发率高等特点，全球每年大约有1 500万脑卒中的病人，其中死亡率高达20%，致残率达50%〔1-2〕。脑卒中严重影响人们的生存质量与生活水平，因脑卒中引发的一系列并发症不仅给患者带来痛苦，同时也增加了家庭和社会的负担。脑卒中引起的死亡人数在我国死亡人数中占第二位，同时脑卒中也是导致多数成年人残疾、生活不能自理的原因之一。脑卒中是一种复杂的多因素引起的神经系统疾病，其中包括不可改变的因素（遗传因素）以及可改变的因素（环境因素），但是这些因素都不能解释脑卒中的发病机制。而流行病学的研究认为脑卒中的发生与遗传因素有较大的关系〔3〕。

微小RNA（miRNAs）是一类内源性非编码小分子RNAs，在真核细胞中主要是由19～25个核苷酸组成，通过结合到目的基因信使RNA（mRNA）3’非编码端，在转录后调节基因的表达，从而miRNAs参与了一系列重要的生命进程，包括细胞增殖、细胞发育、细胞分化、细胞凋亡和新陈代谢等〔4-5〕。单核苷酸多态性（SNP）是常见的遗传变异之一，SNP存在于前体mir-RNA（pre-miRNAs）能影响成熟miRNAs的表达，通过目的基因改变多种生物功能。当前的研究表明SNP的位点存在于4种前体mir-RNAs，包括miR-146a C＞G（rs2910164），miR-149 T＞C（rs2292832），miR-196a2 T＞C（rs11614913）和miR-499 A＞G（rs3746444），并且能与多种影响人类健康的疾病密切相关，例如肿瘤、高血压、心血管疾病和糖尿病〔6-7〕。近来的研究发现miR-149 T＞C，miR-196a2 T＞C等位基因可能是遗传的易感因素〔8-9〕。4种microRNAs会引起血管损伤反应，在循环系统中与血栓形成或炎症通路有关联〔10〕。miR-149 T＞C，miR-196a2 T＞C基因多态性与脑卒中有相关性，但不同人群、不同地区存在差异性和不确定性，因此本研究拟通过对已发表的miR-149 T＞C和miR-196a2 T＞C基因多态性与脑卒中的相关性研究进行Meta分析，以得出较为客观的结论。

1 资料与方法

1.1资料来源与检索策略电子检索PubMed、Web of Science、CBM及中国知网、万方、维普数据库，检索时间从建库到2018年11月，获取有关microRNAs基因多态性和脑卒中的文章。为提高文献的查全率和漏查率，分析过程中将进一步对入选研究的参考文献进行扩大检索，辅以文献追溯法查找相关文献，以提高Meta分析对文献查全率的要求。英文检索词包括microRNAs、miR-149、miR-196a2、polymorphism、SNP、stroke、ischemic、IS、cerebrovascular disease、brain hemorrhage、intracranial hemorrhage、cerebral hemorrhage、cerebral infarction，中文检索词包括miR-149、miR-196a2、微小RNA、基因多态性、脑卒中、脑缺血、脑血管疾病、脑出血、脑梗死、脑梗塞。以PubMed为例，具体检索策略如下：

#1 miR-149 ORmiR-196a2

#2 polymorphism ORSNP

#3 stroke OR ischemic ORcerebrovascular

disease ORbrain hemorrhage ORintracranial

hemorrhage ORcerebral hemorrhage ORcerebral

infarction

#4 case-control ORcase control

#5#1 AND#2 AND#3 AND#4

1.2文献纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 ①研究对象：评估miR-149、miR-196a2基因多态性和脑卒中发病的相关性；②研究设计：文章为病例对照研究；③干预措施：病例组为脑卒中患者，对照组为健康人群；④足够充分的数据可用于计算OR值；⑤对照组基因型分布符合HWE（Hardy-Weinberg Equilibrium）遗传平衡定律。

1.2.2 排除标准 ①重复研究、发表的文献；②对照组不符合HWE遗传平衡；③数据描述不清或样本资料交代不清，统计方法不恰当；④脑卒中诊断不明确或没有根据国际公认的标准；⑤综述文献；⑥非中、英文文献。

1.3质量评估对纳入文献的质量评价采用Newcastle-Ottawa Scale（NOS）评价，通过入选人群、组间可比性、暴露因素测量3个方面共8个条目对文献质量进行评价，满分为9分，6分及以上认为是高质量文献〔11-12〕，①病例确定是否恰当（1分）；②病例的代表性（1分）；③对照组的选择（1分）；④对照组的确定（1分）；⑤实验设计和数据统计分析时考虑病例组和对照组的可比性（2分）；⑥暴露因素的确定（1分）；⑦病例组和对照组暴露因素的确定方法相同（1分）；⑧无应答率（1分）。

1.4数据提取参考Cochrane协作网推荐的方法编制资料提取表，由两名研究者独立筛选文献、提取资料并进行交叉核对，如有不一致观点通过讨论进行解决。提取资料的主要内容为：①文献的基本特征（包括文题、年份、研究者姓名等）；②所纳入文献研究对象的基本特征、干预措施和结局指标。研究特征：研究地区和人群特征、研究组和对照组的例数和年龄特征；数据提取：研究组和对照组的各基因型的分布情况。

1.5统计分析采用Stata12.0进行Meta分析，本Meta分析对于计数资料的效应指标选取比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）表示。异质性检验的检验方法采用Q检验和I2统计量，如果异质性检验结果P≥0.05、I2＜50%，表示各研究间没有异质性，选用固定效应模型，计算合并比值并绘制森林图；如果异质性检验结果P＜0.05、I2＞50%，表示研究间存在异质性，选用随机效应模型。计算合并的OR和95%CI，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1纳入的文献基本特征初步检索出文献65篇，其中PubMed 13篇，Web of Science 8篇，CBM 11篇，中国知网29篇，万方3篇，维普1篇。按照文献纳入排除标准进行筛选，最终剩余8篇文献。见图1。文献对照组都符合HWE检验，共计6 472例研究对象，其中病例3 332例，对照3 140例，纳入研究的基本特征及对照组的HWE检测见表1～2。

图1 文献筛选流程图

2.2 Meta分析的结果

2.2.1 miR-149 rs2292832 对5种遗传学模型（C vs.T，CC vs.TT，CT vs.TT，CC+CT vs.TT，CC vs.CT+TT）进行Meta分析，结果表明携带C或CC基因的人群与脑卒中的发生风险差异有统计学意义，miR-149 rs2292832基因多态性与脑卒中有相关性，人群中携带C或CC基因明显增加了脑卒中的发生风险。结果见表3，森林图见图2。

2.2.2 miR-196a2 rs11614913 对5种遗传学模型（C vs.T，CC vs.TT，CT vs.TT，CC+CT vs.TT，CC vs.CT+TT）进行Meta分析，结果表明携带C或CC基因的人群与脑卒中的发生风险差异无统计学意义，miR-196a2 rs11614913多态性与脑卒中的发生无相关性。结果见表4，森林图见图3。

表1 纳入研究miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913的基本特征

表2 Meta分析中miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913的基因型分布

表3 miR-149 rs2292832遗传学模型森林图结果

图2 miR-149 rs2292832基因多态性与脑卒中发生风险森林图

表4 miR-196a2 rs11614913遗传学模型森林图结果

图3 miR-196a2 rs11614913基因多态性与脑卒中发生风险森林图

2.3发表偏倚和敏感性分析分别对纳入文献进行Meta分析绘制漏斗图，见图4～5，漏斗图基本对称可能会存在发表偏倚，但发表偏倚较小不影响最终结果。对纳入文献逐一剔除进行敏感性分析，并与排除前的合并效应量进行分析比较，发现效应量无明显改变，表明此次研究结果稳定可靠。

图4 miR-149 rs2292832 5种遗传学模型漏斗图

图5 miR-196a2 rs11614913 5种遗传学模型漏斗图

3 讨论

近年导致脑卒中的疾病呈现多样性，其中高血压、糖尿病是熟知的引起脑卒中的最常见疾病。在探讨脑卒中的发病机制的临床研究中，遗传因素与脑卒中的关联性研究是目前的研究热点。动脉粥样硬化、血脂异常、高血压以及高同型半胱氨酸血症等为脑卒中的传统危险因素。近年流行病学的研究表明遗传因素中的基因突变增加脑卒中发生风险性的比例逐渐加重〔21〕。近年的研究发现miRNAs作为小分子RNAs，参与了肿瘤、免疫的功能系统、细胞增殖、心血管疾病和神经系统等多种疾病的病理和生理进程，此外miRNAs还能够调节30%的人类基因表达〔22〕。近年来有关miR-149和miR-196a2基因多态性与脑卒中易感性的研究结果不一致，并且同一种族不同人群、不同地区存在不确定性。为此，本研究就miR-149和miR-196a2基因多态性与亚洲人群脑卒中易感性进行Meta分析，旨在揭示两种miRNAs基因多态性与脑卒中易感性之间的相关性，为遗传学上对脑卒中危险因素的分子诊治具有重要意义。

当前对miRNAs与脑卒中相关性的研究较多，但研究结果不尽相同。本研究通过Meta分析表明miR-149、miR-196a2中仅有miR-149 rs2292832基因多态性与脑卒中的发生有相关性，人群中携带C和CC基因型患脑卒中的风险性明显增加，而miR-196a2 rs11614913基因多态性与脑卒中的发生无相关性。Xiao等〔23〕的Meta分析中，只纳入了两个研究结果，该研究表明miR-149 rs2292832基因多态性能降低脑卒中发生风险。由于不同的研究者纳入研究的样本量的不同而影响了结果的一致性。本研究共纳入了8个研究，通过增加样本量得到了与Xiao等〔23〕的研究不一致的结论，miR-149 rs2292832基因多态性能增加脑卒中的发生风险。本研究比Xiao等〔23〕的研究结果可信度更高。Xiao等〔23〕的纳入研究样本量过少可能是导致与本研究结果不一致的主要原因。miR-149和miR-196a2的等位基因与肿瘤坏死因子α（TNF-α）、亚甲基四氢叶酸、C反应蛋白（CRP）有密切联系，并且miR-149能与亚甲基四氢叶酸转移酶基因的mRNA-3’UTR结合从而调控此基因的表达〔24〕。而亚甲基四氢叶酸转移酶在编码甲硫酸-叶酸代谢中起到重要作用，其在人体内具有活性的5-甲基四氢叶酸（5-MTHFR）的 形 成 过 程 中 起 到 促 进 作 用〔25〕。miR-149 rs2292832位点位于miR-149前体序列非成熟结合区内，miR-149-5p的表达受rs2292832位点的影响，其中携带CC人群体内miR-149-5p的表达量明显高于携带CT和TT人群的表达量〔26〕。携带有miR-149 rs2292832位点基因型CC者体内叶酸水平明显低于基因型TT携带者〔22〕。有研究表明人体内低表达亚甲基四氢叶酸转移酶可明显增加脑卒中的发病风险，并且脑卒中患者体内的叶酸水平与健康人群相比明显降低，而体内叶酸水平较低者通过补充叶酸后脑卒中的发生风险明显降低〔8，10〕。因此可认为miR-149 rs2292832位点C等位基因和CC基因型通过影响成熟miR-149，调控miR-149与亚甲基四氢叶酸转移酶基因结合，降低亚甲基四氢叶酸转移酶基因表达，抑制甲硫酸-叶酸代谢，降低体内5-MTHFR的生成，从而促进脑卒中的发生。体内低5-MTHFR表达可增加血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平，而高Hcy血症是诱发心脑血管疾病的中度危险因素，它可以造成血管内皮损伤和功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶系统，影响脂质代谢等，使机体处于血栓前状态，从而增加了心脑血管疾病发病的危险性〔27〕，通过降低5-MTHFR的生成从而导致血浆Hcy水平增高，促进脑卒中的发生。

本研究纳入文献仅限于中英文符合要求的文献，研究人群均为亚洲人群，具有较好的地区代表性。该研究对揭示亚洲人群miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913基因多态性与脑卒中易感性之间的相关性较为合理、可靠。本研究存在不足是样本量较为局限，今后希望能通过大样本、多中心、同质性的病例对照研究，对不同地区的人群进行研究，进一步阐明基因多态性与脑卒中的关联性。