miR-34b/c基因rs4938723的单核苷酸多态性与少精症的相关性研究

柯红利，阿周存

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003）

精子发生是一个十分复杂的过程，涉及众多相关基因的时空表达调控。相关基因的表达调控异常会引起生精异常，导致生精障碍，如无精症、少精症等〔1〕。微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）通过与靶基因的mRNA结合并沉默靶基因，参与基因的转录后调控〔2〕，而转录后调控是精子发生过程基因表达调控的重要方式，是正常生精不可或缺的〔3〕。有研究显示，miRNA在精子发生过程中发挥重要作用，其异常可能导致生精障碍〔4〕。然而，具体哪些miRNA与生精障碍有关还不完全清楚。

近年来，在小鼠模型中的研究显示，miR-34b/c是小鼠正常生精所必需的miRNA，其异常与小鼠的生精障碍相关〔5〕。这提示miR-34b/c基因也可能与人类生精障碍相关，但目前缺乏相应研究资料。鉴于此，本研究在汉族人群中，对miR-34b/c基因的常见单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点rs4938723的多态性与少精症的相关性进行研究，初步探索miR-34b/c基因与少精症的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象病例组由273个少精症患者组成，来自于四川大学华西医院和大理大学第一附属医院，根据WHO（世界卫生组织）指南诊断为少精症的男性（精子密度小于15×106个/mL）。对照组包括234个精子密度正常的男性。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 PCR扩增 用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒，从研究对象的外周血中提取基因组DNA。SNPrs4938723的PCR扩增引物序列为：5'-CTCTGGGAACCTTCTTTGACCCAT-3'和 5'-TGAGATCAAGGCCATACCATTCAAGA-3'，扩增片段的长度为147 bp。PCR扩增反应的体积为25μL，反应的条件为：94℃预变性5 min，随后进行35个循环（94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s），最后72℃延伸5 min。

1.2.2 基因分型 利用限制性片段长度多态性分析对SNP rs4938723进行基因分型。取PCR产物10μL，用10个单位的限制性内切酶BclⅠ消化过夜，然后在3%的琼脂糖凝胶上进行电泳。基因型TT为1条带（147 bp），TC为3条带（147 bp，118 bp和29 bp），CC为2条带（118 bp和29 bp）。通过对不同基因型的部分标本进行PCR产物直接测序，对电泳分型结果进行验证。

1.2.3 统计学分析 通过计数计算基因频率和基因型频率。用HWE计算器进行Hardy-Weinberg平衡检验。用χ2检验比较患者组和正常对照组之间等位基因和基因型频率之间的差异，检验水准设为P＜0.05。

2 结果

检测到miR-34b/c基因SNP rs4938723位点所具有的TT、TC、CC全部3种基因型。测序结果与电泳分型结果一致，表明所采用的基因分型方法可靠。见图1。

图1 SNPrs4938723的电泳分型结果

SNPrs4938723的等位基因频率和基因频率分布在少精症患者和正常男性间的差异具有统计学意义；少精症患者的等位基因C的频率（35.0%vs.28.2%，P=0.021，OR=1.378，95%CI为1.048～1.789）和基因型CC的频率（13.9%vs.7.3%，P=0.016，OR=2.064，95%CI为1.132～3.764）显著高于正常男性。见表1。经HWE计算器分析检验，SNP rs4938723的基因型分布在少精症患者和正常男性中符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

3 讨论

近年来，一系列研究结果显示，miR-34b/c基因的SNP位点rs4938723的多态性影响多种疾病的发病风险，如冠心病、缺血性中风、类风湿性关节炎和癌症等〔6-10〕，提示miR-34b/c基因可与不同的疾病的发生有关。然而，miR-34b/c基因与生精障碍的关系尚未明确。鉴于miR-34b/c基因在精子发生中发挥着重要作用，推测miR-34b/c基因也可能与人类的生精障碍相关。为了验证上述推测，本研究在273个少精症患者和234个正常男性中，对miR-34b/c基因SNP位点rs4938723的多态性分布进行调查。研究结果显示，SNPrs4938723的基因型分布在少精症患者和正常人群中符合Hardy-Weinberg平衡，表明本研究的对象具有群体代表性；在少精症中SNP rs4938723的等位基因C的频率和基因型CC的频率显著高于正常人群，提示SNP位点rs4938723的多态性与少精症相关，基因型CC可能增加少精症的发病风险（OR=2.064）。

表1 两组患者rs4938723的等位基因频率和基因型频率分布［n（%）］

虽然本研究的结果表明SNP rs4938723的CC基因型可能增加无精症的发病风险，但具体机制还不清楚。SNP rs4938723是一个位于miR-34b/c基因启动子区的C/T变异，其影响相关转录因子与启动子的结合进而影响启动子的活性；与等位基因T相比，等位基因C会降低启动子的活性，使miR-34b/c表达水平下调，导致CC基因型个体的miR-34b/c表达水平显著低于TT和TC基因型个体〔11〕。有研究显示，在无精症和少弱精症患者的睾丸组织或精子中，miR-34b/c的表达水平显著降低，而在正常生精个体中则高表达，提示miR-34b/c的表达水平降低可能影响精子的数量〔12-13〕。此外，在小鼠中的研究表明，高miR-34b/c表达水平是有效调控生精过程中一些关键基因（如Nanos 2基因等）的表达，从而确保生精过程正常进行所必需的〔14-15〕。因此，CC基因型个体的miR-34b/c表达水平降低，可能影响正常的生精过程，进而引起精子数量的减少。这可能是本研究所发现的CC基因型增加少精症发病风险的一个原因。

目前，尚未见有关miR-34b/c基因的多态性与生精障碍相关性的研究报道。本研究首次对miR-34b/c基因SNP位点rs4938723的多态性与少精症的关系进行调查，发现SNPrs4938723的多态性与少精症相关，SNPrs4938723的CC基因型可能增加少精症的发病风险，提示miR-34b/c基因可能参与了少精症的发病。研究结果为进一步阐明miR-34b/c基因在人类生精障碍中的作用提供一些有价值的参考。