大鼠HIRI模型中氧化损伤和Hcy含量的研究

卢建升，田新雁，苏 娟，吕 兴，王永宽，庞 博，周 萍*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

肝缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝脏组织缺血一段时间后再恢复血液灌注，不但没有使肝脏功能、结构恢复，反而加重其损伤程度的现象。HIRI是肝移植、休克复苏、严重肝外伤及肝叶切除等过程中不可避免的，也是影响治疗效果和预后的重要原因之一，严重时可导致患者的肝功能衰竭甚至死亡〔1-2〕。

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是体内重要的氨基酸——蛋氨酸（methionine，Met）经脱甲基等一系列反应生成的中间产物，在人体内含量极少，是一种具有细胞毒性的含硫氨基酸〔3〕。Hcy在重金属离子（如Fe3+或Cu2+）的催化下易发生自身氧化，生成超氧化物、过氧化氢和羟自由基等活性氧参与动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等多种疾病的发生〔4-6〕。

肝脏是代谢Hcy的主要器官，临床研究表明，血浆Hcy水平升高与肝功能损伤存在着密切的联系〔7〕。在HIRI过程中，Hcy是否参与了其损伤的加重，却未见报道。故本研究将通过建立肝缺血-再灌注（24 h）损伤模型，来探讨Hcy含量与氧化损伤在HIRI中的变化。

1 材料

1.1实验动物SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，购自昆明医科大学实验动物中心，合格证号：SYXK（滇）K2015-0002，适应性饲养1周后，建立大鼠HIRI模型。

1.2药物与试剂BCA蛋白质定量试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：20190309）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒（批号：20190718）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（批号：20190718）、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（批号：20190718）和丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号：20190917）均购自南京建成生物工程研究所；同型半胱氨酸（Hcy）测定试剂盒（批号：201907）、透明质酸（HA）测定试剂盒（批号：201907）和层粘连蛋白（LN）测定试剂盒（批号：201907）购自上海泛柯实业有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3主要仪器无创血管夹（上海医疗器械有限公司）；JR-30鼠恒温实验台（成都泰盟软件有限公司）；VCX130超声细胞粉碎仪（SONICS，美国）；冷冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；快速混匀器（常州国华电器有限公司）；超低温保存箱（海尔股份有限公司）；荧光显微镜（OLYMPUS，日本）；多功能酶标仪（Gene Company Limited，美国）；T6紫外分光光度计（北京普析）。

2 方法

2.1实验动物分组取40只SD大鼠随机分为3组：假手术组（S）、缺血组（I）和缺血-再灌注组（I/R）。S组开腹90 min后，根据继续饲养0 h和24 h，随机分为S-I组和S-I/R组，每组10只；I组仅缺血90 min不再灌注，10只；I/R组缺血90 min后，再灌注24 h，10只。

2.2 HIRI模型建立术前24 h禁食不禁水。腹腔注射1%戊巴比妥钠（6 mL/kg）麻醉大鼠，下腹正中切口，暴露出肝脏门三静脉，根据刘俊平等〔8〕的方法，I组和I/R组采用无创血管夹夹闭肝左外侧叶和中叶的肝动脉、门静脉，阻断入肝约70%血流，90 min后除去，S-I组和S-I/R组只进行肝蒂部干扰。S-I/R组和I/R组缝合腹部切口两层，使大鼠从麻醉中恢复，继续饲养24 h后取材（S-I组和I组分别开腹90 min和缺血90 min后直接取材）。大鼠手术过程中保持在鼠台上，控制体温在（37±0.5）℃，大鼠下腔静脉采血（3%肝素钠抗凝），4℃，3 000 r/min离心10 min，分离得血浆-80℃冻存备用。

2.3肝脏采取与匀浆采血结束后，遵循动物伦理道德处死大鼠，分离得大鼠肝左外侧叶。取约1 g肝组织，按质量-体积为1∶9的比例加入0.9%氯化钠溶液，在功率为60%，超声循环5次（超声10 s与冰浴30 s为一个循环）的条件下制备10%匀浆液，4℃，3 000 r/min离心10 min，分离得10%肝匀浆上清液，-80℃冻存备用。

2.4肝组织病理变化苏木精-伊红（HE）染色法取肝左外侧叶部分组织，4%多聚甲醛固定24 h后，制备4μm厚切片，显微镜下观察肝组织病理损伤变化。

2.5肝功能指标测定按照试剂盒说明书步骤操作，于多功能酶标仪505 nm波长测定血浆中AST和ALT活力。

2.6肝组织生化指标检测取肝组织匀浆上清液，采用BCA法测定其总蛋白浓度。分别根据试剂盒说明书测定肝匀浆SOD活力，MDA、Hcy、HA和LN的含量。

2.7数据统计分析应用SPSS20.0统计分析软件分析数据，计量资料均以（s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用LSD-t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1大鼠HIRI模型建立情况通过手术阻断大鼠左肝叶及中叶血供，致大鼠约70%肝组织缺血90 min，恢复供血0 h或24 h的损伤模型的动物存活率高，大鼠HIRI模型建立的情况见表1。

表1 大鼠HIRI模型建立情况

3.2肝组织病理变化HE染色结果显示，S-I组和S-I/R组肝脏中央静脉清晰完整，肝细胞呈索状排列整齐，肝细胞大小均匀，无变性和坏死，见图1A、B；I组肝细胞索状排列不整齐，分布不均匀，有少量变性和坏死，肝窦挤压变形且有明显淤血，有炎性细胞浸润，见图1C；I/R组肝窦受挤压消失，肝细胞明显肿胀，分布不均匀，明显的变性和坏死，有炎性细胞浸润，见图1D。

图1 大鼠肝组织病理观察（HE染色，×200）

表2 大鼠血浆中ALT和AST的活力变化（

表2 大鼠血浆中ALT和AST的活力变化（

注：与S-I组比较**P＜0.01；与S-I/R组比较##P＜0.01。

3.3大鼠肝功能的变化检测血浆ALT和AST的活力能准确反映肝脏的损伤程度。I组和I/R组分别与S-I组和S-I/R组比较，大鼠血浆AST和ALT活力均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

3.4大鼠肝脏氧化指标的变化I组和I/R组分别与S-I组和S-I/R组比较，肝组织SOD活力均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），MDA含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

3.5大鼠肝脏中Hcy含量的变化与S-I/R组和I组比较，I/R组大鼠肝组织Hcy含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见表3。

表3 大鼠肝组织中SOD活力变化，MDA、Hcy、HA和LN含量的变化（

表3 大鼠肝组织中SOD活力变化，MDA、Hcy、HA和LN含量的变化（

注：与S-I组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与S-I/R组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与I组比较◆P＜0.05。

3.6大鼠肝纤维化指标的变化与S-I组比较，I组大鼠肝组织HA和LN的含量变化没有统计学意义（P＞0.05）；与S-I/R组和I组比较，I/R组大鼠肝组织HA和LN含量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

4 讨论

在肝移植、休克和阻断血管的肝脏切除等外科手术过程中，均可发生HIRI现象。影响HIRI的常见因素有缺血时间、缺血程度及再灌注的条件等〔9〕，若再灌注损伤严重，可能诱发肝炎、肝纤维化甚至肝硬化〔10〕。HIRI主要表现为肝细胞坏死，研究〔11-13〕发现其发病机制与氧化应激相关，机体产生广泛的活性氧及脂质过氧化反应等攻击肝细胞，造成肝细胞损伤，表现为SOD活力降低和MDA含量升高等。本研究结果显示，与S-I/R组比较，I/R组的肝脏病理切片损伤明显，肝细胞出现明显的变性和坏死病变，血浆中AST和ALT也显著增高，表明肝缺血-再灌注引起了肝损伤；I/R组肝组织中MDA的含量明显增高（P＜0.01），I/R组MDA含量虽较I组增高但差异没有统计学意义（P＞0.05），说明HIRI模型中对组织造成损伤，不是缺血本身引起的，而是恢复供血后过量的自由基攻击损伤细胞造成的。

当肝脏功能不全或肝脏受损时，将会导致机体糖类、脂质类及氨基酸等代谢障碍，其中Hcy代谢也将会受阻〔14〕。Hcy是一种具有细胞毒性的含硫氨基酸，与多种疾病发生发展相关的因子〔15〕，易在金属离子的存在下发生自身氧化，生成超氧化物、过氧化氢和羟自由基等活性氧进攻组织细胞并导致组织细胞损伤。I/R组肝组织中Hcy的含量比S-I/R组和I组均增高（P＜0.01，P＜0.05），表明在大鼠HIRI模型中，Hcy代谢受阻。据报道〔16〕，Hcy含量的升高能导致细胞发生氧化应激，在大鼠HIRI模型中Hcy可能参与HIRI的发生。此外，与S-I/R组和I组比较，I/R组肝组织中HA和LN的含量均升高（P＜0.05，P＜0.01），说明肝脏缺血-再灌注后，肝组织出现了胶原的沉积增加，与刘俊平等〔8〕研究相符，提示HIRI可能促发肝纤维化的发生。

综上所述，肝缺血-再灌注能通过氧化应激作用引起肝损伤，Hcy含量升高，后期可能促进纤维化的发生，为肝脏疾病的研究提供理论依据。