药效学结合正交试验优选茜花制剂的提取工艺

黄 锐，袁 渊，任桂林，赵 剑，杨思进，李 志，蒲清荣

（西南医科大学附属中医医院，四川泸州 646000）

痛风（gout）是由单钠尿酸盐（MSU）沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱和（或）尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，特指急性特征性关节炎和慢性痛风石疾病〔1〕。中医药学在痛风的防治方面以清热利湿、活血止痛为原则，显示出缩短病程、降低费用、减少并发症等独特优势，已得到国内外医学界的认同〔2〕。随着国内外对痛风研究的不断深入，发现痛风的发病机制与炎症反应和免疫机制密切相关〔3〕。茜花制剂原方是治疗痛风的经验方，由茜草、花椒、通草组成，日服量不超过20 g原生药材，具有凉血散瘀、通络止痛、清热利尿的功效，主要用于治疗痛风引起的关节或肌肉的红、肿、热、痛、麻等症。

由于原方是用60度以上的高粱酒浸泡而成的酒剂，味苦，课题组在不降低临床疗效的基础上，从口感、制剂成本、生产时间等多个方面考虑，拟将酒剂改为胶囊剂，本试验结合药效学试验优选茜花制剂的初步工艺，并利用正交试验以有效成分的相对含量为评价指标，确定最佳提取工艺，为茜花制剂的实际生产提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器日本岛津高效液相色谱仪（LC-20AT泵、SPD20A检测器、CTO-10AS进样器、LcSolution色谱工作站）；AUW120D电子天平（日本岛津）；JP全数字超声波发生器（武汉嘉鹏电子有限公司）；AU680全自动生化分析系统（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2试剂对照品大叶茜草素（中国食品药品检定研究院，批号：111898-201102）；茜草、花椒、通草均购自泸州天植中药饮片有限公司，批号分别为160201、160101、160101，经西南医科大学附属中医医院制剂室赵剑主任中药师鉴定，符合《中华人民共和国药典》（2015年版）一部该药材项下规定；酵母膏（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20160518）；腺嘌呤（武汉大华伟业医药化工有限公司，批号：03-004-1603009）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯净水；其他试剂为分析纯。

1.3材料雄性SD大鼠，体质量180～220 g，由西南医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（川）2013-2017。

2 方法

2.1提取工艺

2.1.1 水提 按处方比例花椒除外称取3倍全方药材，加12倍水煎煮3次，每次1 h，过滤，滤液合并，浓缩成1 g/mL，加入花椒粉即为样品溶液，备用。

2.1.2 不同浓度的醇加水提 按处方比例花椒除外称取全方药材，加入6倍量不同浓度的乙醇浸泡48 h，渗漉速度为1 mL/min，收集渗漉液，备用。药渣加处方量12倍水煎煮3次，每次1 h，过滤，滤液与上述渗漉液合并，浓缩成1 g/mL，加花椒粉即为样品溶液，备用。

2.2大叶茜草素的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取大叶茜草素的对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成质量浓度为0.153 g/L的对照品溶液。

2.2.2大叶茜草素的相对含量测定 取“2.1”项的各样品溶液，用65%乙醇定容至600 mL，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 除茜草外按处方比例取药材，按“2.1.2”项提取，按“2.2.2”项制备，即得。

2.3药效学实验

2.3.1 给药剂量 茜花制剂临床经验用量为16 g原生药，成人每日用量为0.266 7 g/kg（成人体质量按60 kg计），按成人给药剂量乘6.25计算大鼠给药剂量。

2.3.2 高尿酸血症大鼠模型制备和给药 取SD雄性大鼠96只，随机分为8个组，每组12只，分别为正常组、模型组、别嘌醇组（3.5 mg/kg）、5个实验组。除正常组外，其余各组大鼠灌胃给予酵母膏15 g/kg和腺嘌呤200 mg/kg，每日1次，于第7天灌胃给予各实验组大鼠对应剂量的药物，正常组、模型组给予等量蒸馏水，每日1次，持续7 d，第7天给药1 h后断尾取血检测尿酸水平〔4-6〕。

2.4正交试验选“2.2”与“2.3”项大叶茜草素含量较高，且药效较好的实验组，采用正交实验对粉碎粒度、乙醇用量、浸泡时间、渗漉速度4个因素进行考察。

2.5数据处理与分析所有数据使用Excel建立数据库，数据采用SPSS12.0软件进行统计学分析，结果以（±s）表示，统计方法采用方差分析，组间数据比较采用双侧t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1大叶茜草素含量测定结果

3.1.1 色谱条件 色谱柱Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（25：50：25），流速1.0 mL/min，柱温40℃，检测波长250 nm，进样量10μL〔7-9〕。见图1。

图1 茜花制剂高效液相色谱图

3.1.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品溶液0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 mL分别于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，按“3.1.1”项下色谱条件，取10μL进样检测。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=4.056×107x+16 607.83，r=0.999 6，线性范围为0.006 12～0.061 20 g/L。

3.1.3 精密度试验 取“2.2.1”项对照品溶液10μL，按“3.1.1”项色谱条件，连续进样6次，测得大叶茜草素峰面积RSD为0.93%，表明仪器精密度良好。

3.1.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“3.1.1”项色谱条件测定，大叶茜草素峰面积的RSD为1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.1.5 重复性试验 取正交试验1号样品，按“3.1.1”项进行测定，进样6次，计算得大叶茜草素平均含量为34.82μg/mL，RSD为1.82%。

3.1.6 回收率试验 精密量取正交试验1号样品6份，每份1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加入“2.2.1”项对照品溶液0.2 mL，加甲醇定容至刻度，摇匀。按“3.1.1”项色谱条件测定，计算回收率。加样回收率平均值为98.18%，RSD为1.4%，表明该方法切实可行。

3.1.7 大叶茜草素含量测定 取“2.2.2”项制备的供试溶液，按“3.1.1”项色谱条件进样测定。

3.2药效学实验结果模型组大鼠尿酸水平比正常组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示造模成功；别嘌醇组、65%工艺组大鼠尿酸水平与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05），而与模型组比较，两组大鼠尿酸水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明持续给药第7天，仅别嘌醇组与65%工艺组能显著降低高尿酸血症大鼠尿酸水平。见表1。

表1 不同提取工艺对大叶茜草素含量和高尿酸血症大鼠尿酸水平的影响

3.3正交试验由表1可知，65%工艺组大叶茜草素含量为174.04μg/mL，较其他工艺组高，药效学试验也表明该组能显著降低高尿酸血症大鼠的尿酸水平。因此，选用65%乙醇作为渗漉浓度，选择粉碎粒度、乙醇用量、浸泡时间、渗漉速度为考察因素，收集渗漉液，测定大叶茜草素的含量，正交试验因素水平见表2。

正交试验设计方案及结果见表3，方差分析见表4。由试验结果可知，各因素对提取效果影响主次为A＞B＞D＞C。方差分析结果显示因素A即粉碎粒度和因素B即乙醇用量对渗漉工艺有显著影响，因素C、D无显著性影响，选择最佳提取工艺为

表2 正交试验因素水平

表3 L9（34）正交试验设计方案及结果

表4 正交试验方差分析

3.4复核试验按处方比例称取药材3份，按优选的提取工艺A3B3C1D2即将药材粉碎过五号筛，加8倍量65%乙醇浸泡24 h，渗漉速度为2 mL/min进行提取，按“3.1.1”项下方法测定大叶茜草素含量为216.27、216.71、213.03μg/mL，RSD为0.93%，提取率为60.45%、60.58%、59.55%，RSD为0.93%。说明优选的提取工艺稳定可行，提取率较高。

4 讨论

君药茜草具有凉血、止血、祛瘀、通经功效，用于吐血、衄血、崩漏、外伤出血、经闭瘀阻、关节痹痛、跌扑肿痛〔4〕，是茜花制剂中凉血散瘀、止痛作用的主要药物，其主要成分大叶茜草素是从茜草中分离出的萘醌类化合物，具有明显的生物活性〔10-11〕。课题组通过药效学及正交试验考察粉碎粒度、乙醇用量、浸泡时间、渗漉速度对茜花制剂提取工艺的影响，确定最佳工艺为：药材粉碎过五号筛，加8倍量65%乙醇浸泡24 h，渗漉速度为2 mL/min。该方作为治疗痛风的经验方，用60度以上的高粱酒浸泡而成，疗效佳，因此，用65%乙醇提取也与原工艺相符。

建立高尿酸血症模型是本试验进行药效学筛选的关键，酵母膏加腺嘌呤致大鼠高尿酸血症试验需注意大鼠对酵母膏和腺嘌呤的耐受性，熟练灌胃，避免对大鼠造成不必要的伤害而导致死亡；静脉取血避免溶血现象发生，离心时应尽量取澄清的血清进行尿酸检测，避免出现个别尿酸值异常偏高。选择酵母膏加腺嘌呤致大鼠高尿酸血症模型对工艺进行初步筛选，对优选出的渗漉条件更具科学意义。