蛛网膜下腔出血后基底动脉和软脑膜动脉缝隙连接蛋白表达与血管痉挛的关系

蔡昌呈 雷超 何豹 魏丽丽 赵冬

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是神经外科临床最常见的危急重症之一。流行病学调查显示，自发性SAH占所有脑血管疾病的1%～7%，具有非常高的致死率和致残率[1]。尽管目前针对SAH的发病机制与研究有所突破，但SAH后的致死率、致残率却未得到明显改善。脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)的治疗一直以来是改善SAH预后的重要方法，但既往针对CVS的治疗往往不能取得临床满意效果[2]。近年来，众多学者将研究方向转向了颅内微血管痉挛。研究证实颅内动脉瘤破裂后会出现脑大血管痉挛[3]；动物实验发现，SAH后软膜微动脉出现了病理性收缩和功能障碍，脑实质微动脉和穿支微动脉亦出现收缩并导致皮层血流减少[4]。缝隙连接蛋白在血管收缩中发挥重要作用，其基本组成单位为连接蛋白(Connexin，Cx)。血管壁上存在Cx37、Cx40、Cx43和Cx45 4种缝隙连接蛋白。当血管壁中缝隙连接蛋白水平发生变化时，可导致血管系统疾病的发生[5]。该研究通过观察SAH后软脑膜微动脉和基底动脉缝隙连接蛋白的变化，以及缝隙连接蛋白在大动脉和微动脉痉挛中的作用差异，从而了解缝隙连接蛋白与血管痉挛之间的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物选取成年、雄性、健康SD大鼠90只，体重(300±50)g，购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心〔许可证号：SCXK(新)2016-0001〕。大鼠饲养于石河子大学医学院动物实验中心，温度18～25℃，湿度为40%，光照、黑暗各12 h。将SD大鼠按随机数表法分为对照组(21只)、假手术组(20只)、SAH模型组(26只)和18β-甘草次酸(18β-GA)干预组(23只，以下简称干预组)。实验操作符合美国国立卫生研究院制定的《实验动物关怀和使用指南》(1996年修订版)，同时该研究通过石河子大学实验动物伦理委员会批准通过。

1.2 主要试剂及设备主要试剂包括RIPA裂解液(P0013B，碧云天)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0011，碧云天)、丙烯酰胺(0341-100G，Amresco)、甲叉丙烯酰胺(0172，Amresco)、PVDF膜(RPN303F，国药集团化学试剂有限公司)、兔多抗GAPDH(yb-0755R，Abcam)、兔多抗Cx40(yb-465Hu01，Abcam)、鼠单抗Cx43(yb-277Bo01，Abcam)、鼠单抗Cx45(yb-480Gc01)。主要设备包括大鼠脑立体定向仪(ALC-H)、Aquapro超级纯水仪(AJY-0502)、石蜡包埋机(KH-BL)、恒温振荡器(ZH-D)、光学显微镜(LWD200-37FT)、水平电泳仪(EBU-4000)、烘片机(KD-TH1)、离心机(TG16MW)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9245AE)等。

1.3 方法

1.3.1SAH模型建立和干预：(1)SAH模型组：根据改良版颅内视交叉前池二次注血法建立SAH模型[6]。按体重350 mg/kg给予大鼠腹腔注射3%(质量浓度)戊巴比妥钠麻醉，进行颅内穿刺后借助注射器自股动脉吸取0.2 mL新鲜股动脉血，由PE10管滴注入蛛网膜下腔，骨蜡封闭骨窗，灭菌缝合后正常喂养，48 h后，再次向蛛网膜下腔注入0.2 mL自体动脉血。建模后每天按体重10 mg/kg腹腔注射2%(体积分数)DMSO溶液，至模型建立后第7天。光学显微镜下观察大鼠蛛网膜下腔存在大量红细胞表明建模成功。(2)假手术组：往蛛网膜下腔注入等量生理盐水，余步骤同SAH模型组。(3)对照组：不进行任何操作。(3)干预组：在SAH模型操作的基础上，按体重10 mg/kg腹腔注射含10 mg/mL 18β-GA的2%(体积分数)DMSO溶液，1次/d，共7 d。

1.3.2神经行为评分：建模后第7天，采用Garcia神经行为学法[7]对SD大鼠进行评分：(1)自主活动：正常活动3分，轻微影响2分，严重影响1分，不活动0分；(2)提住鼠尾使大鼠四肢悬空：对称3分，不对称2分，偏瘫1分；(3)握住鼠尾放置桌面边缘：对称3分，轻微不对称2分，明显不对称1分，一侧前肢无运动0分；(4)将大鼠置于铁笼上：攀爬轻松，抓持有力3分，一侧受损2分，不能攀爬或倾向于转圈1分；(5)本体感觉反应：双侧对称3分，一侧刺激迟钝2分，一侧无反应1分；(6)触碰两侧胡须观察大鼠反应：对称3分，不对称2分，无反应1分。

1.3.3取材：建立模型后第7天，处死大鼠，留取软脑膜动脉、脑实质内微动脉和基底动脉，提取血管壁中的蛋白，均保存于-80℃备用。

1.3.4软脑膜直径测定：在显微镜下用无齿眼科镊留取额顶部软脑膜动脉，除去附在血管上蛛网膜，并用剪刀和镊子仔细去除微动脉周围残留的结缔组织，进行HE染色，采用Leica Biosystem扫描切片，再用K-Viewer软件检测软脑膜直径。

1.3.5压力肌动图实验：按文献[8]方法进行压力肌动图实验检测基底动脉血管直径。在显微镜下用无齿眼科镊轻柔的去除大脑中动脉及蛛网膜后，留取额顶部脑实质的内微动脉，为确保实验精度，留取脑颞顶部皮质下2 mm左右的实质动脉，借助视频显微测量法以及校准视频尺寸分析器对血管段进行分析与测量。

1.3.6缝隙连接蛋白检测：按文献[9]方法取血管组织加入RIPA裂解液提取蛋白后进行电泳、转膜、免疫，按1∶1000的比例稀释一抗GADPH、Cx40、Cx43、Cx45；然后放在摇床上于室温环境中进行120 min孵育处理，接着和摇床一起置于冰箱(4 ℃)内过夜孵育一抗，然后1×TBST洗膜处理后孵育二抗(1∶5000，由辣根标记)，漂洗后进行显影、定影，采用蛋白免疫印迹检测软脑膜和基底动脉处缝隙连接蛋白水平。

1.4 统计学处理采用SSPS20.0软件进行数据分析，符合正态分布计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(One way ANOVA analysis)，两两比较采用SNK-q检验；相关性分析采用Pearson相关性分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠死亡情况假手术组死亡2只，对照组死亡3只，模型组死亡8只，干预组死亡5只，最终每组18只。

2.2 模型建立假手术组大鼠脑组织腹侧Willis环周围肉眼未见明显血凝块或积血，SAH模型组肉眼可见Willis环周围及延髓处可见血凝块或者积血。光学显微镜观察显示，假手术组大鼠蛛网膜下腔未见红细胞，SAH模型组可见大量红细胞。表明SAH建模成功。结果见图1。

2.2 神经行为学评分对照组、假手术组、SAH模型组和干预组神经行为学评分比较差异有统计学意义(P<0.01)。SAH模型组神经行为学评分较假手术组低(P<0.05)，干预组神经行为学评分较SAH模型组高(P<0.05)，对照组与假手术组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

2.3 动脉直径比较对照组、假手术组、SAH模型组和干预组大鼠软脑膜动脉和基底动脉直径比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。与假手术组比较，SAH模型组软脑膜动脉和基底动脉直径均较细(P(0.05)；与SAH模型组比较，干预组软脑膜动脉和基底动脉直径均较粗(P<0.05)。结果见表1、图2～3。

注：SAH：蛛网膜下腔出血，表1、图2～6同；A、C：假手术组；B、D：SAH模型组 图1 SD大鼠SAH造模全脑肉眼观察结果(A、B)及蛛网膜下腔病理观察结果(C、D，HE染色，比例R=250 μm)

组别n神经行为学评分软脑膜动脉直径(μm)基底动脉直径(μm)对照组1817.00±0.6537.16±2.49337.29±19.87假手术组1817.00±0.6136.97±2.78335.61±20.16SAH模型组1811.20±1.47a26.67±3.15a259.38±37.02a干预组1813.50±1.32b33.17±2.83b312.16±29.17bF值5.3524.5263.625P值<0.01<0.05<0.05

注：与假手术组比较，aP<0.05；与SAH模型组比较，bP<0.05

2.4 缝隙连接蛋白表达各组SD大鼠软脑膜动脉处和基底动脉处缝隙连接蛋白比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。与假手术组比较，SAH模型组软脑膜动脉处和基底动脉处Cx40蛋白表达水平较低，而Cx43和Cx45蛋白表达水平较高(均P<0.05)；与SAH模型组比较，干预组软脑膜动脉处和基底动脉处Cx40蛋白表达水平较高，而Cx43和Cx45蛋白表达水平较低(均P<0.05)。结果见表2、图4。

2.5 动脉直径与缝隙连接蛋白相关性分析SAH模型组大鼠软脑膜动脉直径和基底动脉直径与Cx40均呈正相关(r=0.749，P<0.05；r=0.866，P<0.05)，而与Cx43和Cx45均呈负相关(r=-0.836)，P<0.05；r=-0.697，P<0.05；r=-0.411，P<0.05；r=-0.979，P<0.05)。结果见图5、6。

注：A：对照组；B：假手术组；C：SAH模型组；D：干预组 图2 各组大鼠额顶部软脑膜动脉直径(HE染色，×100)

注：A：对照组；B：假手术组；C：SAH模型组；D：干预组 图3 显微镜下观察各组大鼠额顶脑实质基底动脉血管直径(×100)

表2 各组SD大鼠不同动脉处缝隙连接蛋白水平比较

组别n软脑膜动脉处Cx40Cx43Cx45基底动脉处Cx40Cx43Cx45对照组180.88±0.050.65±0.060.60±0.040.65±0.040.51±0.030.43±0.04假手术组180.88±0.040.65±0.050.59±0.050.65±0.050.50±0.040.42±0.05SAH模型组180.75±0.04a0.91±0.04a0.81±0.05a0.45±0.08a0.67±0.04a0.69±0.06a干预组180.81±0.07b0.81±0.08b0.74±0.07b0.61±0.06b0.58±0.05b0.51±0.03bF值13.5961.4768.57611.85115.71613.818P值0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

图4 各组SD大鼠软脑膜动脉处(A)和基底动脉处(B)缝隙连接蛋白水平(蛋白免疫印迹)

图5 SAH模型组大鼠软脑膜动脉直径与缝隙连接蛋白相关性分析

图6 SAH模型组大鼠基底动脉直径与缝隙连接蛋白相关性分析

3 讨论

研究发现，不同组织分布的血管以及不同类型的血管中缝隙连接蛋白表达水平不同，动物种属不同缝隙连接蛋白在血管壁内的分布可能亦有所不同[10]。对于循环系统，Cx37所发挥的调控机制为肾素分泌[11]。Cx37对血管动脉粥样硬化斑块产生发挥关键性影响[12]。

本研究结果显示，SAH模型组及经18β-GA干预组大鼠软脑膜动脉和基底动脉处Cx40蛋白表达情况均低于假手术组，表明SAH会导致大鼠软脑膜动脉和基底动脉处Cx40蛋白表达水平降低。有学者发现敲除Cx40的大鼠会发生高血压以及无规律性动脉收缩表现[13]。Cx40表达减弱时，平滑肌细胞和内皮细胞间通道机能减弱，使内皮源性超级化因子穿过缝隙连接受限，进而对平滑肌细胞舒张机能产生干扰[14]。还有研究证实，如将血管内膜去除，则导致血管完全丧失舒张功能[15]。据此推测，对于CVS发生时Cx40具有保护效应，在血管舒张方面发挥关键功能，然而其确切作用机制尚不清楚。

Cx43是缝隙连接蛋白的一种，其广泛分布在多种组织器官中，特别是在血管内皮细胞及心肌细胞中表达最多，缝隙连接作为细胞间信号传导的主要形式之一，其若发生病理变化将会导致多种疾病的发生。研究证实，细胞表面由Cx43组成的半通道可介导细胞内外物质通讯，通常情况下半通道处于关闭状态，可维持细胞的稳定性，而在一定条件下(如炎症刺激、新陈代谢抑制等)半通道可被激活，使缝隙连接开放的扳机点触发，从而打开缝隙连接通路，进而使痉挛加剧，加速细胞死亡[16]。通过观察敲除Cx45蛋白的大鼠发现，大鼠血管发生明显失常改变，提高大鼠死亡概率[17]。本研究结果显示，与假手术组相比，SAH后软脑膜动脉和基底动脉处Cx43和Cx45表达水平较高。据此推测，SAH后软脑膜动脉和基底动脉处CX43蛋白表达水平升高，将会进一步促使脑血管壁中细胞间收缩信号传导增加，最终造成CVS的发生。目前尚缺乏有关SAH后脑血管内Cx45变化的相关研究，SAH与脑血管内Cx45的确切关系有待进一步深入分析。

本研究通过分析软脑膜血管直径和基底动脉血管直径与缝隙连接蛋白表达水平的相关性发现，软脑膜处和基底动脉处Cx40表达与软脑膜动脉直径和基底动脉直径均呈正相关，而Cx43和Cx45表达水平与两动脉直径均呈负相关，提示软脑膜动脉处Cx40对缓解CVS起主要作用，而Cx43和Cx45升高可加重CVS。该研究结果显示，SAH模型组大鼠经缝隙连接蛋白非特异性阻断剂18β-GA干预后，软脑膜动脉处和基底动脉处Cx40蛋白表达水平较高，而Cx43和Cx45蛋白表达水平较低，从侧面表明缝隙连接蛋白与CVS具有相关性。

综上所述，大鼠SAH后，软脑膜动脉和基底动脉缝隙连接蛋白发生改变，缝隙连接蛋白和CVS具有相关性，经18β-GA干预后可缓解血管痉挛。深入研究缝隙连接蛋白表达和血管痉挛之间的相关性，可为今后脑血管病的防治奠定理论基础。