CNQX拮抗断尾诱发小鼠前扣带回皮质神经元c-fos基因的表达

李娜然，商丽宏，杨宇，姚阳，吴敏范

（沈阳医学院 1.机能与形态实验中心；2.生理学教研室，沈阳 110034）

研究［1-2］表明，截肢手术后有50%～60%以上的患者伴有幻肢痛（phantom limb pain，PLP）。前扣带回皮质（anterior cingulate cortex，ACC）已被大量的研究［3-4］证明是痛觉的重要中枢，在疼痛感知、认知和情绪等关键大脑功能中发挥重要作用。PLP患者ACC的脑血容量显著增加，与疼痛强度密切相关［5］；截肢后大鼠ACC对外周刺激与中枢刺激的反应增强［6］；神经元的c-fos基因表达［7］、NK-1受体［8］、AMPA/Kainate受体［9］与痛觉有关。目前，PLP的发病机理尚不清楚。将小鼠尾末端截断常用于PLP产生机制的研究［4］。研究［8］表明，NK-1受体参与断尾引起小鼠ACC神经元c-fos基因表达显著增强的过程。但是，AMPA/Kainate受体是否参与此过程尚未见报道。因此，本研究采用免疫组化方法探讨PLP的产生机理，为治疗PLP提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组

沈阳医学院实验动物中心提供雌性成年昆明种小鼠36只，体质量（27±6）g［动物生产许可证编号：SCXK（辽）2010-0001］。1%戊巴比妥钠40 mg·kg-1体质量腹腔麻醉小鼠，随机均分为6组，每组6只：空白对照组（不做任何处理）；断尾（尾末端2.5 cm用剪刀截断）后0.5 h组；iv CNQX组（尾静脉注射1%CNQX 1 mg·kg-1体质量后10 min+断尾后0.5 h）；iv NS组（尾静脉注射同体积生理盐水后10 min+断尾后0.5 h）；ith CNQX组（蛛网膜下腔注射CNQX 10 μg·10 μL-1生理盐水后10 min+断尾后0.5 h）；ith NS组（蛛网膜下腔注射同体积生理盐水后10 min+断尾后0.5 h）。

1.2 ACC c-fos基因表达的检测

断尾后0.5 h，将上述各组小鼠断头，取脑，置于4 ℃ 4%多聚甲醛中过夜固定。连续冠状面-20 ℃冰冻切片，厚度为15 μm，用免疫组化方法常规染片及洗片等，最后使用树胶封片。使用显微图像分析仪（×400放大倍数）检测切片ACCc-fos阳性细胞的积分光密度（integrated optical density，integrated OD）和面积百分比。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 iv CNQX对断尾诱发小鼠ACC神经元c-fos基因表达的影响

空白对照组正常小鼠ACC神经元有少量c-fos基因表达，而断尾后0.5 h小鼠ACC神经元c-fos基因表达显著增强，阳性细胞OD和面积百分比显著高于空白对照组（P＜ 0.01）；iv CNQX拮抗断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达显著增强，阳性细胞OD和面积百分比与空白对照组比较无统计学差异（P＞0.05），但显著低于断尾后0.5 h组（P＜ 0.01），而ivNS组断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达显著增强没有影响，阳性细胞OD和面积百分比显著高于空白对照组及iv CNQX组（P＜ 0.01），见表1，图1。

2.2 ith CNQX对断尾诱发小鼠ACC神经元c-fos基因表达的影响

表1 尾静脉或蛛网膜下腔注射CNQX对断尾诱发小鼠ACC神经元c-fos基因表达的影响Tab.1 Effect of iv or ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice

图1 iv CNQX对断尾诱发小鼠ACC神经元c-fos基因表达的影响 ×400Fig.1 Effect of iv CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

与空白对照组正常小鼠比较，断尾后0.5 h小鼠ACC神经元c-fos基因表达显著增强（P＜ 0.01）；ith CNQX拮抗断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达显著增强，阳性细胞OD和面积百分比与空白对照组比较无统计学差异（P＞ 0.05），但是，显著低于断尾后0.5 h组（P＜ 0.01），而ith NS组对断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达显著增强没有影响，阳性细胞OD和面积百分比显著高于空白对照组及ith CNQX组（P＜0.01），见表1，图2。

3 讨论

图2 Ith CNQX对断尾诱发小鼠ACC神经元c-fos基因表达的影响 ×400Fig.2 Effect of ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

c-fos基因及Fos蛋白在中枢神经系统表达的部位与伤害性信号的传导、整合分析有关［7-8］；大鼠截肢后ACC对外周刺激与中枢刺激的反应增强［6］。本研究发现，断尾后0.5 h小鼠ACC神经元c-fos基因表达显著增强，表明小鼠ACC的神经元能接受伤害信号的传入，参与断尾产生的中枢神经系统的可塑性改变。本研究结果为深入研究PLP提供了新的实验依据。

PLP是截肢者术后常见的并发症。目前，PLP的发病机理尚不明确。NK-1受体、AMPA/Kainate受体与痛觉有关［8-9］。NK-1受体参与断尾引起小鼠ACC神经元c-fos基因表达显著增强的过程［8］。但是，AMPA/Kainate受体是否参与此过程尚未见报道。本研究观察到iv CNQX AMPA/Kainate受体拮抗剂拮抗断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达显著增强，说明外周AMPA/Kainate受体参与此过程。CNQX不易透过血脑屏障，因此本文深入研究了ith CNQX对断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达显著增强的影响。发现ith CNQX拮抗了断尾诱发的ACC神经元c-fos基因表达的显著增强，说明中枢AMPA/Kainate受体也参与了此过程，外周与中枢AMPA/Kainate受体可能作为镇痛药物治疗PLP的候选靶点。