十里香茶离体培养及再生体系研究

(西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/西南林业大学园林园艺学院，云南 昆明 650224)

十里香茶是栽培型茶树，属山茶科、茶属、茶种(Camellasinensis(L.) O.Ktze.cv.Kunming Shilixiang)，是一种稀有的中小叶、高香型茶树品种，并且具有较强的抗寒旱、抗病虫、耐贫瘠能力[1]。十里香又名“十里贡茶”，是云南历史悠久、文化内涵丰富、经济价值较高的传统高端绿茶，其口感滋味醇和香气浓郁，曾在“2011世界绿茶评比大会”获得金奖。由于革命战火和城市建设等，十里香茶曾历经多次衰败甚至险遭灭绝，现今虽恢复有200亩种群基地，但约半数为新植幼苗，发展较为薄弱[2]。通过对十里香茶进行离体快繁，可使其珍贵优良的品种资源、高端稀缺的品质资源以及传统名茶的品牌资源得到充分的保护和发展。与扦插等方式相比，植物离体组培可在材料有限的情况下，不受地理、气候环境条件的限制，就能实现十里香茶高效快速地大量繁殖[3-4]，是一种保存和交换其种质资源的有效方式，也是对其新品种培育、生物学基础研究和产品开发的不间断的物质基础和来源[5-6]。因此通过离体培养建立再生体系是解决十里香茶树产量繁殖、种质保护及交流、遗传改良的一种有效途径。

目前国内外在茶树组织与器官培养方面发展迅速，可通过茶树茎尖、腋芽、茎段、叶片、子叶、胚和花药培养诱导形成愈伤组织或产生不定芽的方式获得完整的再生植株[7-9]。由于茶树自身富含的酚类化合物易氧化导致外植体褐变坏死以及自身携带较多内生菌易导致外植体污染的原因，使得茶树组织培养过程中主要存在着外植体易污染、褐化的难题[10-11]。所以本研究拟通过选取十里香茶不同外植体材料、消毒时间、光照条件以及培养基添加物的方法，得到低污染效果的同时，减轻十里香茶树外植体褐化的情况，并确定适宜的生根培养基，从而完成十里香茶由田间腋芽到完整无菌组培苗的过程，为后续工厂化育苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验材料为西南林业大学树木园种植的十里香茶树，树龄约50年，于2018年10月采集健壮、无病虫害枝条上的带有腋芽的茎段。为比较不同幼嫩程度的外植体的褐化情况，选取了轻微木质化的带芽茎段和完全幼嫩的带芽茎尖2种材料。

1.2 试验方法

1.2.1外植体预处理及消毒

将采回的外植体先用自来水持续冲洗2 min，再用8 g·L-1多菌灵溶液浸泡20 min，然后用自来水持续冲洗45 min，接着放入无菌水中低温(4 ℃)处理12 h。

本次实验升汞溶液的不同清洗时间设置为10、15、20 min，在超净操作台以每5棵外植体作为单组进行1次消毒，先用75%的酒精浸泡30 s，然后在无菌水中清洗4次，接着使用0.1 g·L-1升汞溶液洗涤，浸泡过程中不断摇晃，之后进行8次无菌水洗涤，最后接种到培养基。

1.2.2腋芽萌发诱导

将上述消毒处理的外植体材料分别接种于培养基MS+0.2 mg·L-1萘乙酸(NAA)+6 mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+3 000 mg·L-1活性炭(AC)+3.0%蔗糖、0.7%琼脂(pH=5.6)上，于接种7 d统计消毒时间对外植体污染率和褐化率的影响，筛选出消毒最佳条件。

污染率(%)=(污染的外植体数/接种的外植体数)×100%；

褐化率(%)=(褐化的外植体数/接种的外植体数)×100%)。

另外，将以最佳消毒处理的外植体分别接种于含有不同PVP(3，6，9，12 mg·L-1)、AC(1 000，2 000，3 000，4 000 mg·L-1)和维生素C(Vc)(500，1 000，1 500，2 000 mg·L-1)浓度组合的培养基MS培养基上(附加0.2 mg·L-1NAA)，于接种30 d统计不同培养基对腋芽生长及外植体褐化的影响。

同时，将上述消毒外植体分别接种于不同光照处理的培养基MS+0.2 mg·L-1萘乙酸(NAA)+6 mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+3 000 mg·L-1活性炭(AC)+3.0%蔗糖、0.7%琼脂(pH=5.6)上，于光照培养7 d后观察统计不同光照条件对褐化率的影响。光照培养条件分别为：

1) 5 d暗培养+12 h强光照(2 000～3 000 Lx)培养；

2) 连续12 h强光照(2 000～3 000 Lx)培养；

3) 连续12 h弱光照(750～1 500 Lx)培养。培养温度为(25±2)℃，湿度为70%～80%。

1.2.3不定芽生根诱导

将污染和褐化得到有效控制且生长状况良好的外植体接种到MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS，附加1 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)，观察生根数，出现 2 条以上视为有效根，于第30天统计生根率。

生根率(%)=(生根的外植体数/接种的外植体数)×100%。

1.2.4数据分析

使用Excel软件和SPSS 22.0软件进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同条件对外植体褐化程度的影响

2.1.1消毒时间对外植体褐化的影响

结果表明，消毒10 min褐化率最低，为31.11%，但污染率高至45.55%，而进行20 min消毒污染率减低为24.44%，褐化率却升高至72.22%(表1)，茎叶明显完全褐化。消毒时间15 min，污染率25.56%，褐化率40%，茎叶少有褐化现象，外植体生长良好，是能控制污染和褐化问题的最佳消毒处理时间。

表4 含不同抗褐化剂的培养基褐化及生长情况统计

培养基编号不同抗褐化剂浓度/(mg·L-1)VcPVPAC褐化率/%外植体生长状况150012-20.00±3.33bc++210009-23.33±6.67bc++315006-13.33±3.34bc++420003-10.00±3.33c++++510003-22.22±1.92bc++6-3400026.67±6.67bc+7-6300010.00±3.33c++++8-9200016.67±5.77bc++9-12100017.78±1.92bc++10500-300030.00±3.33b++111000-200013.33±3.34bc+++121500-100015.56±1.93bc++132000-100025.56±1.93bc++1410009200026.67±0.00bc+1510009300021.11±1.92bc++1610009400012.22±1.92bc++ck---78.89±1.92a+

注：表中“+”越多表示生长状况越好。

表1 不同消毒时间处理后的外植体第7天褐化率及污染率统计

消毒时间/min污染率/%褐化率/%1045.55±3.85a31.11±5.09b1525.56±1.93a40.00±3.33a2024.44±5.09b72.22±1.92a

注：表中同列数据的不同大小写字母表示在0.05 水平有差异显著性。下同。

2.1.2不同幼嫩程度的外植体的褐化情况

在确定升汞消毒时间为15 min后，观察不同幼嫩程度外植体的褐化情况。发现轻微木质化的材料褐化程度远小于完全幼嫩材料的褐化程度。完全幼嫩的外植体，于2 d后褐化趋于严重，第7天褐化率高达73.33%(表2)，材料几乎已完全褐化，而轻微木质化的外植体呈现健康的绿色，少有褐化。

表2 不同幼嫩程度的外植体第7天褐化率统计

外植体幼嫩情况褐化率/%轻微木质化20.00±3.33完全幼嫩73.33±6.67

2.1.3不同光照条件对外植体褐化的影响

全程光周期培养的外植体在2～3 d后开始呈现不同程度的褐变，而经过5 d暗培养的材料少有褐化现象并生长良好，褐化率为28.89%(表3)，未经过暗培养的材料褐化率分别高至67.78%和51.11%，外植体基本已完全褐化。

2.2 不同培养基对腋芽萌发生长情况的影响

经过4周的观察发现，不同配比的添加物对十里香腋芽的萌发生长有显著的影响。由表4可知，未添加任何抗褐化剂的ck培养基因褐化率过高，外植体无显著生长变化；而使用抗褐化剂的培养基褐化率均可降低至27%以下，外植体均有不同程度的生长变化。其中，4号2 000 mg·L-1Vc+3 mg·L-1PVP和7号6 mg·L-1PVP+3 000 mg·L-1AC的培养基中外植体萌发力强，生长状况最优，且褐化率为最低值10%，并且再经过2周的观察发现其生长势一直保持最优，外植体呈健康绿色，茎叶生长粗壮，是十里香腋芽萌发生长最理想的培养基。11号(1 000 mg·L-1Vc+2 000 mg·L-1AC)的培养基褐化率13%，萌发力足,生长状况良。3号和16号培养基的褐化率虽然保持在较低范围，但是外植体却生长缓慢，萌发力弱，长势不明显，不利于实验的后续进行。另外，高浓度的AC和低浓度的PVP搭配的6号培养基，以及3种抗褐化剂均搭配的14号培养基生长状况也不理想，不能促进十里香腋芽的萌发和生长。

表3 不同光照条件的外植体第7天褐化率统计

2.3 不同培养基对不定芽生根的影响

本实验将污染和褐化得到良好控制的外植体接种于不同浓度的MS培养基，经过连续30 d的观察，发现不同浓度的MS培养基影响外植体的生根能力。MS浓度越低，外植体生根率越高，且根长越长。1/8 MS培养的外植体根的增长速度最快，生根率为80%，根长2.6 cm(表5)，其根粗壮且长，1/4 MS次之，其次为1/2 MS，根增长速度最慢且根长最短的为MS培养基，其生根率为33.33%，根长0.5 cm，根细弱短小。

3 结论与讨论

正常情况下增加外植体消毒的时间虽然会降低污染率，但褐化现象会加重[12-13]，邬秀宏等[14]在升汞消毒6 min时将外植体的污染率和褐化率保持在50%和57%，而本实验对外植体进行多菌灵浸泡和低温预处理后，升汞溶液消毒15 min可以将污染率和褐化率降至26%和40%，所以对外植体进行预处理可以有效减少污染和褐化的发生。腋芽是茶树离体组培中较有效的材料，具有更高的繁殖率和稳定的遗传特性[15-17]；新梢旺盛生长期到新梢半木质化期的材料所含细菌少，生活力和分化能力较强，所以选择合适的材料也能减少褐化的发生[18-19]。本实验选取的秋季萌发的轻微木质化腋芽对酒精和升汞溶液的伤害抵抗作用更强一些，在经过一系列洗涤消毒后，幼嫩外植体因抵抗能力弱在消毒过程中易受到伤害而导致不能正常生长[20]，所以完全幼嫩的腋芽容易受损伤而褐变，褐化程度明显比轻微木质化的腋芽高。后续可选取春季萌发的十里香茶腋芽进行研究，筛选出茶树组培更低污染及褐化率的外植体材料。对于不同光照条件下，暗培养5 d的材料褐化少有发生，是由于在无光条件下材料处于能降低多酚氧化酶活性的环境不适合合成酚类物质，从而减轻了材料的褐化[21]。

表5 不同浓度的MS培养基对无菌苗生根的影响

注：表中“+”越多表示增长速度越快。

邬秀宏等[14]将茶树外植体接种在MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1 mg·L-1GA3+ 0.02 g·L-1核黄素的培养基时褐化率为13.3% ；雷攀登[21]单独添加PVP、AC、Vc时可以分别将褐化率降低至21.3%、30.8%、26.5%。而本实验得出十里香茶树生长最优培养基为MS+ 0.2 mg·L-1NAA+2 000 mg·L-1Vc+3 mg·L-1PVP或MS+0.2 mg·L-1NAA+3 000 mg·L-1AC+ 6 mg·L-1PVP，可以将褐化率降为10%，说明PVP、AC、Vc作为抗褐化剂组合使用时的效果较为明显。刘海龙等[22]通过添加不同浓度激素和芽的不同剪切方式进行正交实验优化了澳洲茶树组培中增殖周期、增殖倍数、有效芽数等指标，降低了组培产业化育苗的成本，后期可参考类似方法进一步筛选出十里香茶树高效的继代增殖技术，以满足低成本、大规模、高效率、长时间地生产十里香茶。生根培养是离体快繁中的重要阶段，生根率和根的状态直接影响苗木的栽培成活率[23]，本实验得出最利于十里香茶生根的培养基为1/8浓度MS附加1 mg·L-1IBA。IBA和NAA均广泛用于生根调节，孙紫薇[24]使用0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-1IBA可使藤茶组培苗生根率达到86.7%；谢恩俊[25]采用50 mg·L-1IBA浸泡组培苗基部5 min后再转入生根培养基中的方法，可使中黄1号茶组培苗根呈辐射状生长、侧根多，颜色翠绿。本研究中筛选最优生根培养的条件较单一，后期有待对十里香茶树生根条件作进一步优化。另外组培苗的炼苗和移栽也是工厂化育苗的一个必不可少的环节，吴丽君等[26]筛选出V黄心土∶V蛭石= 3∶1的基质可使金花茶组培苗移栽成活率高达94%，后续可结合不同炼苗时间与不同配比的基质得到适合十里香茶炼苗和移栽的条件，确定出一条完整的十里香茶树离体再生规模化育苗的生产线。

通过本研究方法离体培养的十里香茶的健壮无菌组培苗，可作为十里香茶种质资源保护以及异地种质资源交流，也能加深茶学研究的深度和扩大品种选育的广度。后续为保护其他名古茶树种质资源以及建立其快繁体系组培苗化提供指导，使其得到产业化的应用，成为能高效稳定保存和保护我国优良古茶树品种种质资源的方法。