早期吸入布地奈德对过敏性哮喘模型大鼠肺功能、骨桥蛋白及α-SMA的影响

杨卫，许晓云，监士宁，王海洋2，吴欣

(1.保定市第一中心医院呼吸内二科，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院，河北 保定 071000)

支气管哮喘是呼吸系统常见疾病，近些年中国的哮喘患病率正在迅速上升[1]，严重威胁着人类的身体健康。支气管哮喘是一种以气道反应性增高和可逆性气流受限为特征的气道慢性炎性疾病，多种炎症细胞参与了炎症过程。支气管哮喘患者的气道上皮完整性被破坏，细胞外基质沉积，同时伴有黏液腺增生、平滑肌增殖、气道周围新生血管增多[2]，从而导致气道管壁增厚和管腔变窄，最终出现不完全可逆性的气流受限。目前认为，气道重塑有可能是难治性哮喘的重要原因之一，因此近些年人们对气道重塑的关注度也越来越高。目前对气道重塑的发生机制尚未完全明确，临床中尚缺乏防治哮喘气道重塑的有效措施。进一步研究气道重塑的可能机制，寻找新的治疗靶点，是需要进一步研究的重点。研究哮喘大鼠早期吸入布地奈德后肺功能、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的变化，同时研究了骨桥蛋白与肺功能、气道重塑的关系。

1 材料与方法

1.1 制备哮喘动物模型

清洁级雄性SD大鼠60只，体质量130～170 g，随机分成模型组、对照组和治疗组，每组20只。3组大鼠分别于第1天、第7天向腹膜腔注射含卵清蛋白100 mg、氢氧化铝100 mg混悬液2 mL，百日咳疫苗1 mL(含50亿菌株)进行致敏。第15天后将模型组、治疗组实验动物置于20 cm×30 cm×40 cm不完全密闭的自制熏箱中雾化吸入卵清蛋白，隔日1次，卵清蛋白浓度由1%逐渐递增到1.5%、2.0%、2.5%、3.0%(每一种浓度雾化4次)。对照组全程应用0.9%生理盐水雾化吸入。治疗组每日应用布地奈德溶液(0.5 g/L)雾化吸入20 min治疗，每天2次，对照组和模型组同时吸入等量的生理盐水。

1.2 肺功能检测

最后一次雾化吸入治疗24 h后进行肺功能检查。使用1%戊巴比妥钠(90 mg/kg)腹膜腔注射，麻醉满意后行颈正中切口，充分暴露气管，切开气管，连接动物呼吸机。建立颈静脉液路，检测基本气道阻力。经颈静脉依次注入生理盐水和乙酰胆碱(乙酰胆碱剂量依次为6.25、12.50、25.00、50.00 μg/kg)，检测注药后曲线下面积的变化，每次注药间隔5 min。

1.3 支气管肺泡灌洗液收集

肺功能检测完毕后，采用4 ℃无菌生理盐水2 mL灌洗左肺：灌洗时将生理盐水经气管插管缓慢注入，轻轻按摩胸壁，保留30 s后缓慢抽出，反复3次，收集全部支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，经两层纱布过滤，离心(1 200 r/min，4 ℃，10 min)，吸取上清，分装，-80 ℃冰箱保存。

1.4 病理

留取右肺上叶，经4%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下观测气道上皮、气道周围炎症细胞浸润情况。

1.5 肺泡灌洗液骨桥蛋白测定

步骤按骨桥蛋白ELISA试剂盒说明书进行。

1.6 免疫组化法检测气道α-SMA

切片常规脱蜡至水；0.01 mol/L PBS清洗3次，0.3%甲醇-过氧化氢室温孵育20 min；蒸馏水清洗3次，每次5 min；0.01 mol/L构橼酸缓冲液(pH6.0)微波炉内修复，98 ℃维持20 min，冷却至室温；10%山羊血清，37 ℃温箱湿盒内孵育30 min；滤纸吸去多余血清，分别加入鼠抗大鼠IgG单克隆抗体；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加生物素化二抗(山羊抗鼠)工作液，37 ℃温箱湿盒内孵育30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，37 ℃温箱湿盒内孵育30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；DAB显色2.5 min；自来水冲洗，终止显色；梯度乙醇脱水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明；中性树胶封固。阴性对照用PBS替代一抗，步骤同上。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 肺功能检查结果

与对照组比较，模型组与治疗组气道阻力升高(P<0.05)，治疗组气道阻力较模型组减低(P<0.05)；静脉注入生理盐水和6.25 μg/kg乙酰胆碱后气道阻力变化差异无统计学意义。增加乙酰胆碱浓度后3组实验动物均出现气道阻力增加，提示气道反应性增高，其中模型组最为明显(表1)，3组间差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 肺功能检测结果

曲线下面积为比值，没有单位。

2.2 肺组织HE染色

与对照组比较，模型组气道黏膜皱襞增多、平滑肌增厚，气道周围炎症细胞明显增多，治疗组同样存在上述情况，程度较模型组轻(图1)。

图1 肺组织HE染色( HE×200倍)

2.3 气道α-SMA免疫组化结果

模型组和治疗组肺组织α-SMA光度值较对照组明显增高(P<0.05)，治疗组表达低于模型组(P<0.05)(图2、图3和表2)。

图2 α-SMA表达(免疫组化×400倍)

图3 气道α-SMA 表达

2.4 支气管肺泡灌洗液骨桥蛋白检测结果

模型组和治疗组大鼠支气管肺泡灌洗液骨桥蛋白表达高于对照组(P<0.05)，治疗组较模型组表达降低(P<0.05)(表2、图4)。

表2 支气管肺泡灌洗液骨桥蛋白和气道α-SMA检测结果

组别n骨桥蛋白/(pg/mL-1)α-SMA 对照组20155.32±36.410.14±0.04 模型组20386.43±85.210.38±0.11 治疗组20267.33±64.210.21±0.08F38.7931.06 P<0.01<0.01

图4 骨桥蛋白表达

3 相关性分析

3.1 对骨桥蛋白和气道α-SMA进行相关性分析

对骨桥蛋白和气道α-SMA进行相关性分析，结果显示，骨桥蛋白和α-SMA之间呈正相关(r=0.71,P<0.01)(图5)。

3.2 对骨桥蛋白和气道基本阻力进行相关性分析

对骨桥蛋白和气道基本阻力进行相关性分析，结果显示，骨桥蛋白和气道阻力之间呈正相关(r=0.90,P<0.01)(图6)。

图5 骨桥蛋白和气道α-SMA相关性

图6 骨桥蛋白和气道基本阻力相关性

4 讨论

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，气道高反应性是支气管哮喘的重要临床特征之一，因此肺功能及气道反应性检测是诊断支气管哮喘、评估病情的重要手段。研究中，首先对3组实验动物进行了肺功能检测，检测结果显示哮喘模型组气道基本阻力较对照组升高，静脉注入乙酰胆碱后哮喘模型组气道阻力变化幅度较对照组明显增高，提示气道反应性增高，因此哮喘动物模型制备是成功的。治疗组气道基本阻力较模型组减低，在静脉注射乙酰胆碱后气道阻力变化幅度低于模型组，提示雾化吸入布地奈德可以降低气道阻力，改善肺功能。

气道重塑是气道对损伤性刺激的修复反应，也是支气管哮喘的重要特征之一。气道重塑是指支气管哮喘气道上皮受损后出现的管壁结构性改变，包括上皮细胞增生、上皮下纤维化、杯状细胞化生、平滑肌细胞增生与肥大、基质蛋白沉积等。气道重塑的结果往往是平滑肌增殖、肥大，气道胶原沉积，最后导致气道管壁增厚、管腔狭窄。气道重塑后的支气管结构和功能与正常的气道结构、功能有所不同，因此气道重塑有可能是哮喘反复发作和顽固性哮喘的重要病理基础，其程度与哮喘患者的病情严重程度相关。

骨桥蛋白是一种分泌性糖基化磷蛋白，又称为特异性成骨细胞因子-2[3]，各种组织和体液中均有存在，正常肺组织中也有少量骨桥蛋白表达。在疾病状态下骨桥蛋白可以在支气管上皮细胞、平滑肌细胞、单核-巨噬细胞及T淋巴细胞等多处表达。目前认为骨桥蛋白与支气管哮喘密切相关，研究[4]发现，哮喘动物模型中嗜酸性粒细胞、单核-巨噬细胞和T淋巴细胞表达骨桥蛋白增加，骨桥蛋白能够促进炎性细胞向气道内迁移、参与气道炎症以及气道重塑等过程。骨桥蛋白还具有促进嗜酸性粒细胞趋化的作用，研究[5]显示，哮喘患者血中的骨桥蛋白明显升高，与嗜酸性粒细胞具有一致性，并且哮喘患者支气管肺泡灌洗液中骨桥蛋白也明显升高[6]，其水平与嗜酸性粒细胞水平呈正相关。同时，骨桥蛋白还能够促进中性粒细胞向气道炎症部位迁移，促进气道平滑肌的增生、加速气道重塑[7]，因此骨桥蛋白与气道平滑肌纤维化、气道重塑关系密切[8]。本研究显示，骨桥蛋白增高程度与哮喘气道反应性呈正相关，提示骨桥蛋白与哮喘肺功能结果密切相关，有可能参与肺功能调节。同时研究显示，骨桥蛋白可以刺激成纤维细胞激活、气道平滑肌增殖，其表达情况与气道平滑肌面积和胶原沉积情况明显相关。有学者[9-10]发现，敲除骨桥蛋白基因的哮喘小鼠比模型组小鼠气道高反应性减低、纤维化减少、胶原沉积减轻、气道平滑肌面积减少，因此骨桥蛋白在哮喘气道重塑中起着重要作用，细胞因子骨桥蛋白的过度表达能够加速气道重塑。

肌动蛋白(actin)是平滑肌的重要蛋白成分之一，也是细胞骨架微丝的基本成分， 具有构成细胞支架、维持细胞形状、参与细胞运动的作用。 肌动蛋白包括 α 、β 、 γ 三种亚型，其中α所占比例最高。α-SMA可以分为收缩型和增殖型两种表型，其中收缩型多见于成熟的血管平滑肌细胞，增殖型多见于发育早期或病理过程中的血管平滑肌细胞。α-SMA能够反映平滑肌细胞的数量和平滑肌收缩能力的大小，因此α-SMA的表达增多提示气道反应性增高、气道重塑程度加重。 正常大鼠气道周围有少量 α-SMA表达，哮喘大鼠模型制备过程中，1周后肺组织中α-SMA mRNA表达即可增加，2周α-SMA mRNA增加将更为明显。本研究发现，哮喘大鼠气道周围α-SMA表达明显增多，并且与骨桥蛋白的表达呈正相关，提示骨桥蛋白与α-SMA的增殖密切相关，通过吸入布地奈德治疗后骨桥蛋白和α-SMA的表达均出现不同程度下降，提示吸入布地奈德治疗可以下调骨桥蛋白和α-SMA的表达，抑制气道重塑。

与全身用糖皮质激素相比，吸入性糖皮质激素具有不良反应少、用量小的优点，能够有效减轻气道高反应性和气道炎症反应，但是吸入糖皮质激素是否能够有效抑制气道重塑目前相关研究并不多。研究[11]认为，糖皮质激素可以减少机体骨桥蛋白 mRNA 的表达水平，这与本研究结果相符合。故本课题组认为吸入布地奈德能够抑制骨桥蛋白和α-SMA的表达，其机制有可能与吸入布地奈德后气道内炎症反应减轻，骨桥蛋白和α-SMA产生减少等因素有关，其中多条信号传导途径参与了这个过程，上述研究为早期吸入布地奈德治疗哮喘气道重塑提供了理论基础。而且，吸入布地奈德对气道重塑的影响与哮喘动物模型肺功能是相符合的，但是深层次的机制还需要后续的研究进一步了解。