潜在抑癌基因eIF4E3野生型和突变体质粒的构建*

2020-05-19姚运红熊敏涵胡新荣

黑龙江医药 2020年4期

姚运红，袁炜，熊敏涵，张叶，胡新荣

广东医科大学病理学系、肿瘤研究所，广东东莞 523808

真核翻译起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E），是真核细胞翻译起始和调控的核心成分，能够选择性地控制肿瘤基因的翻译和表达。目前已经明确在哺乳动物中eIF4E有三种不同的家族成员，包括eIF4E1、eIF4E2、eIF4E3，其在结构标记、功能特征及表达形式上各有不同［1］。eIF4E3是抑癌基因，eIF4E在众多肿瘤中过量表达［2］。过量表达的eIF4E选择性地起始c-Myc等众多经典癌基因的翻译表达，从而促进癌细胞转化、增殖、抗凋亡、侵袭及肿瘤血管生成等［3］。本研究拟构建并鉴定eIF4E3野生型、eIF4E3突变体C69a、w86a真核过表达质粒，为进一步对eIF4E3研究及为肿瘤治疗寻找新的靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株及表达载体：大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5a、PIRES2-EGFP载体（本实验保存），eIF4E3野生型插入片段序列，eIF4E3C69a突变体是eIF4E3野生型在69位点C变为A突变而来；eIF4E3W86a突变体是eIF4E3野生型在86位点W变为A突变而来。主要试剂：EcoRI、BamHI、NheI限制性内切酶（美国NEB公司）PCR产物回收试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒（日本TAKARA公司）T4 DNAligase（美国Thermo公司）Gold View I型核酸染色剂（北京Solarbio公司）高纯度质粒小提中量试剂盒（北京天根公司）。

1.2 方法

1.2.1 eIF4E3基因片段、RT-PCR扩增及产物纯化：eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a质粒载体构建，参照公司质粒构建说明书。实验步骤如下：逆转录反应（RT-PCR）扩增获得 cDNA样本。RT-PCR扩增条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。以cDNA样本为模板，用构建的上下游引物进行PCR扩增获得eIF4E3野生型及其突变体序列片段。eIF4E3 PCR引物上游引物序列为：primer 5'-GGCGAATTCATGGCGCTGCCCCCG-3'，下游引物序列为：primer 5'-GCGGATCCTTAGTGTTTTCCACGTC⁃CACCTTCA-3'，PCR反应体系为：2×power Taq PCR Mas⁃ter Mix 10 μl，Forward Primer P1（10 μM）1 μl，Reverse Primer P1（10 μM）1 μl，cDNA Template100ng ddH2O 总量加到20 μl，反应条件94℃预变性5 min，94℃变性45S，55℃退火1 min，72℃延伸5 min 40个循环，取适量产物，用1%琼脂糖凝胶电泳实验鉴定产物，鉴定结果正确，PCR产物剩余部分用PCR产物回收试剂盒回收并纯化（试剂盒说明书），回收产物于-20℃保存。

1.2.2 目的片段eIF4E3及空载质粒PIRES2-EGFP双酶切与纯化、回收：用限制性内切酶EcoRI、BamHI双酶切eIF4E3基因片段及空载质粒PIRES2-EGFP。用限制性内切酶NheI、BamHI分别双酶切eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因片段及空载质粒PIRES2-EGFP。将eIF4E3酶切产物进行回收；提取的质粒经琼脂糖凝胶电泳，找到相应的目的条带切胶并回收。

1.2.3 目的片段和载体质粒的连接和转化、提取、鉴定：使用T4 DNA Ligase产品将目的片段与线性载体进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。挑选长出的克隆并摇菌扩增，提取质粒进行后续PCR及测序。PCR引物和扩增的反应体系和反应条件同上。扩增出的目的片段为675bp。重组质粒双酶切鉴定真核表达载体PIRES2-EGFP具有卡那霉素抗性，本实验中选取酶切位点分别为Eco⁃RI、BamHI，NheI、BamHI。根据内切酶说明书，对重组质粒进行双酶切鉴定。将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，成像仪下曝光并拍照。重组DNA测序将提取的质粒DNA送往华大基因生物技术有限公司测序并分析结果。

2 实验结果

2.1 目的基因eIF4E3扩增结果

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，从扩增图可以看到3条大小约为675bp的条带，与预期的野生型（eIF4E3）和突变型（C69a、W86a）基因大小一致（图1）。

图1 eIF4E3野生型和突变体基因PCR扩增电泳图

2.2 重组质粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-C69a、PIRES2-EGFP-W86a双酶切及鉴定结果

经过琼脂糖凝胶电泳分析以后回收得到的PCR产物与PIRES2-EGFP空载体进行双酶切后，用连接酶进行连接用含有卡那霉素的LB培养基进行铺板长菌，挑取2～3个单克隆进行扩增并提取质粒最后进行双酶切及PCR鉴定。双酶切后可以得到大约675bp的片段（图2），进一步进行菌液及其质粒的PCR鉴定，同样可以看出大约675bp的片段（图3），说明eIF4E3野生型及其突变体成功插入到PIRES2-EGFP载体上。

图2 eIF4E3野生型和突变体重组质粒双酶切鉴定图

图3 eIF4E3野生型和突变体菌液及质粒PCR电泳图

2.3 重组质粒测序结果

将重组质粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69a、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69W86a上插入的目的基因eIF4E3、C69a、W86a片段进行DNA测序，经过Blast比对和分析，结果显示eIF4E3、C69a、W86a基因正确插入到真核表达载体PIRES2-EGFP中，其与目的序列一致，测序结果（图4）。

3 讨论

图4 eIF4E3野生型和突变体质粒测序图

eIF4E3是最近年新发现的一种潜在的抑癌基因。本实验中我们成功的将eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因链接到真核表达载体pIRES2-EGFP中。我们选用的pIRES2-EGFP真核表达载体容易进入细胞，容量比较大，易于检测，在临床实验中应用比较广泛。eIF4E3仅存在脊索动物中，而且研究发现只存在于脊索动物的睾丸、骨骼肌、心肌、脾脏和肺脏等组织中，尤其在睾丸中表达水平最高［3］。2013年Borden［4］等人的研究发现过表达eIF4E3能够竞争结合eIF4E的靶mRNA，并且能够阻止VEGF等因子的翻译表达，这提示eIF4E3是对抗eIF4E的潜在抑癌基因。过表达eIF4E3可与eIF4E竞争结合eIF4E的靶mRNA，例如CyclinD1、c-Myc、VEGF等并阻止其翻译表达。Gartenhaus［5］等人进一步发现eIF4E3除了抑制eIF4E1的功能外，还可以自己起始n-Myc、HMGA、CDX2、Twist等的翻译，而这些基因通常都不是eIF4E1的靶基因，这表明eIF4E3可以起始不同于eIF4E1的靶基因的翻译。此外，在药物、放射、缺氧、缺营养等条件下，eIF4E表达下降［6-8］，因此eIF4E已成为研究肿瘤靶向治疗的最热门靶点之一［9］。

本实验成功构建了PIRES2-EGFP-eIF4E3野生型，PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a、PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a突变体质粒，经测序检测，序列与预期相符。eIF4E3野生型，突变体 C69a、w86a的构建为进一步研究其在肿瘤的作用及机理，为肿瘤治疗寻找新的靶点奠定了基础。