MiR－646在前列腺癌及前列腺增生组织中的表达差异及临床意义

陈勇杰，许 春

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）是目前临床上最常用的前列腺癌标志物，虽然其具有较好的特异性，但其敏感性较低，使其诊断早期前列腺癌的价值有限，探求前列腺癌早期高敏感性的肿瘤标志物是当前的热点研究。研究发现miRNA在多种肿瘤中具有异常的表达，可作为肿瘤标志物的一个潜在靶标。在子宫鳞癌、骨肉瘤及肾癌等多种肿瘤中miR－646 表达下调［1－4］，而 miR－646 是否在前列腺癌组织中表达下调，甚至作为抑癌miRNA为前列腺癌提供新的诊疗方法。该研究采用RT－PCR法检测前列腺癌组织及前列腺增生组织中miR－646mRNA的表达差异，同时分析miRNA－646与前列腺癌临床特征和预后的关系，为前列腺癌的临床诊断及预后评估提供帮助。

1 资料与方法

1.1一般资料前列腺癌组织标本来源于笔者所在医院2014年1月—2016年12月确诊前列腺癌行前列腺根治性切除术患者。年龄：46～80岁，年龄≥60岁者20例，＜60岁者58例；Gleason分级：≤6级26例，7级16例，≥8级36例；肿瘤直径≥3 cm者43例，＜3 cm者35例；组织分化程度：高分化26例，中分化34例，低分化18例。 根据TNM分期Ⅰ期患者10例，Ⅱ期患者52例，Ⅲ期患者16例 （TNM分期参照国际抗癌联盟第七版TNM分期标准）。对照组标本来同期该院住院的前列腺增生行前列腺剜除术患者，其中年龄42～78岁，两组年龄等一般情况无统计学差异（P＞0．05）。两组标本置于液氮中冻存保存。前列腺癌患者在手术前均未接受放疗及化疗。试验前对于每位患者均按照医学伦理委员会要求向每位患者家属告知同时请家属签署知情同意书。

1．2方法

1．2．1 mRNA的提取和逆转录 用Trizol抽提total RNA。取组织50～100 mg，加入1 ml TrizoI充分裂解，加氯仿200 ml混匀，室温静置 15 min，12 000 g 4℃离心15 min。在上层中水相移至15 ml EP管中，加入等体积异丙醇振荡混匀；在4℃条件下静置30 min，沉淀RNA，同时在4℃12000 g离心10 min。弃去上清，加入1 ml 75%预冷乙醇（DEPC处理水配制）洗涤一次，4℃离心5 min。弃去上清，加适量DEPC处理水完全溶解。分光光度法检测RNA浓度及纯度。逆转录cDNA采用Takara公司primer Scdpt RT reagent Kit，按说明书严格操作。反应体系：5 ×PrimeScfiptRTMasterMix （for RealTime）2 μl，RT Rrime for miR －646 2 μl，total RNA 100 ～500 Hg，RNase Free dH2O up to 10 μl。

1.2.2 RT－PCR方法 采用 FastStartUniversal SYBRGreenMaster mix试剂盒进行操作。PCR反应体系为FastStartUniversal SYBRGreenMaster mix 10ul，miR－646Pmimer（forward）0．5，miR－646Pmimer（reverse）0．5，CDNA1，RNase free 水 20 μl。 U6 用作内参。 反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃15 s，60℃30 s。共40个循环。每个检验指标做3个复孔，取其均值计算。

1.2.3 PSA的检测 PSA检测前列腺癌患者空腹静脉血，自然凝集30 min，8℃ 4000 r/min离心15 min，分离血清。采用Elecys2010电化学发光法。测定前在室温进行，严格按照说明书进行测定。

1．3统计学方法计量资料以（x±s）表示；计数资料以频数表示。计量资料比较在满足正态分布时采用t检验；不满足正态分布采用秩和检验。计量资料相关性分析采用Pearson积差相关系数，计数资料的相关性分析采用Spearman秩相关系数。所有数据均采用SPSS 21．0软件进行统计分析。以P＜0．05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-646在前列腺癌组织样本中表达下调通过RT－PCR方法对前列腺癌手术切除下来的癌组织以及良性前列腺增生组织进行miR－646的表达的检测，结果显示miR－646在癌组织检测结果为（0．66±0．12）；在癌旁组织检测结果为（1．13±0．31），研究分析提示，miR－646在前列腺癌组织中表达显著低于良性前列腺增生组织，差异具有统计学意义（P＜0．001）。

2.2前列腺癌患者组织miR-646和血清TPSA水平的相关性分析将前列腺癌患者组织miR－646和血清TPSA水平进行Sperman相关性分析，结果显示前列腺癌组织中miR－646和PSA的表达呈负相关（r=－0．267，P＜0．001，图 1）。

图1 前列腺癌组织中 miR-646与血清TPSA的表达呈负相关

2.3 miR-646与前列腺癌患者临床特征的关系miR－646的表达与患者年龄、Gleason分级、肿瘤组织大小、肿瘤的分化程度及TNM分期等临床特征关系（表1）。结果提示不同Gleason分级、肿瘤分化程度及TNM分期患者癌组织中miR－646的表达的差异具有统计学意义（P=0．002；P=0．011；P=0．013），而进一步进行相关性分析研究提示Gleason分级、肿瘤分化高低及TNM分期程度与miR－646的表达呈负相关（r=－0．368；r=－0．295；r=－0．336）。 见表 1。

表1 miR-646表达与78例前列腺癌患者临床特征之间关系

3 讨论

前列腺癌的发病率逐渐上升，每年发病率全世界160余万，死亡36万6000人［5］，尽管近些年相关研究取得了一定进展，仍存在前列腺良性疾病的过度治疗及因延误诊断，导致前列腺癌转移影响预后。目前前列腺癌的早期肿瘤标志物的研究是当前的热点。

miRNA（microRNA）是一种由 18～25 个左右核苷酸组成的内源性的非编码小分子 RNA，主要通过与靶蛋白mRNA的3’末端非翻译区结合介导靶蛋白mRNA的降解， 进而起到对靶基因调节作用［6，7］，研究发现 miRNAs与人类的生长发育、免疫功能及众多疾病的发生发展关系密切［8－11］，尤其在恶性肿瘤中，表达异常的miRNA通过靶向结合癌基因或是抑癌基因，发挥抑癌或促癌作用。例如在前列腺癌中发现高表达的 miR－21－5p通过靶向结合PTEN促进癌细胞的增殖及转移［12］。而前列腺癌中miR－145低表达，其可通过靶向结合SENP1抑制前列腺癌细胞的生长［13］。既往研究发现在子宫鳞癌、骨肉瘤及肾癌等多种恶性肿瘤中miR－646表达的表达下调，根据以上研究，该研究采用RT－PCR法检测前列腺癌中miR－646mRNA的表达，分析其表达的相关性以及与临床病理特征和预后的关系，为前列腺癌的临床诊断及预后评估提供帮助。

该研究搜集了78例前列腺癌癌组织，以良性增生前列腺组织标本为对照组，通过RT－PCR方法对癌组织及良性增生前列腺组织进行miR－646表达含量的检测。结果提示miR－646在前列腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织。鉴于抑癌miRNA在癌组中常常低表达，该研究结果提示了miR－646可能在前列腺癌的发生发展过程中起到抑癌基因的作用。同时对78例癌组织中miR－646的表达与特异性较明显的TPSA进行相关性分析，结果提示miR－646的表达与TPSA呈负相关。为进一步了解miR－646与前列腺癌的关系，笔者对miR－646的表达与患者临床特征进行分析，结果提示在不同年龄组、肿瘤大小组中miR－646的表达差异无统计学意义（P＞0．05）；而患者中不同 Gleason 分级、肿瘤分化程度及TNM分期miR－646的表达差异存在显著性（P=0．002；P=0．011；P=0．013），且 Gleason 分级、肿瘤恶性程度及TNM分期与miR－646的表达呈负相关（r=－0．368；r=－0．295；r=－0．336），而 miR－646 在不同年龄、肿瘤大小患者表达方面差异均无统计学意义。

该研究提示，miR－646表达的高低可能与前列腺癌的预后呈负相关，其中低表达miR－646预示了前列腺癌患者的预后不良。鉴于该研究纳入的前列腺癌患者例数有限，在下一步的研究中将通过扩大病例样本数量及评估5年生存率来进一步证实本研究的结果。组织中检测miRNA对取材要求标准低，且具有较高的敏感性及特异性，未来miR－646在前列腺癌组织中的检测可能成为诊断及评估前列腺癌患者预后的一个重要参照指标。