蜱传脑炎病毒(TBEV)SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

陆兴洁，王 迪，王泽东，张 力，姬宏卫，魏 峰，刘 全

(1.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118；2.军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.佛山科学技术学院 生命工程与科学学院，广东 佛山 528000)

蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis viruses,TBEV)是一种可引起中枢神经系统急性病症的人兽共患蜱传黄病毒属病毒[1]。主要包括远东、西伯利亚和欧洲等3个亚型，我国流行株为远东型。TBEV可使患者出现高热、意识模糊、肌肉瘫痪、脑膜刺激症等病症，还可使牛、马、羊等家畜出现体温升高、精神萎靡、肢体麻痹等症状[2]。给人类公共卫生安全及畜牧业养殖带来严重危害。

TBEV实验室常用的检测方法有病原学检测、血清学检测和分子生物学检测。病原学检测主要通过细胞分离或接种乳鼠进行检测，但所需时间长和敏感性低限制了其临床应用[3]。血清学方法可检测出病毒在人或动物体内的抗体或抗原，但是由于黄病毒属病毒间存在广泛的交叉反应，出现假阳性而导致检测特异性不高[3]。分子生物学检测方法主要有巢式PCR和荧光定量PCR(包括探针法和染料法)，巢式PCR适合于大量样品的高通量检测，但只能简单的对核酸进行定性，不能实时监控核酸扩增量，且两轮PCR增加了敏感性的同时也延长了检测时间[4]。探针法(TaqMan)荧光定量PCR具有很好的特异性和敏感性，但探针合成价格较贵，设计较好的探针引物较难[5]。SYBR Green核酸染料法PCR不需要设计探针，除去了探针合成费用，设计简单，且敏感性和特异性与探针法差异不大，目前已有报道将核酸染料法PCR应用于多种病毒检测[6-7]。目前已有学者将巢氏PCR及探针法荧光定量PCR应用到TBEV的临床检测，但是未见有SYBR Green核酸染料法荧光定量PCR应用于TBEV的报道[8-9]。本试验选用SYBR GreenⅡ核酸染料建立一种针对TBEV的实时荧光定量PCR检测方法，旨在建立一种快速、高效、廉价的TBEV检测方法，为TBEV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 毒株远东型TBEV、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTSV)均由本实验室保种[10-11]。

1.2 主要试剂与仪器PCR 仪(Applied Biosystems 2720)；电泳仪(国产三恒电泳仪10型)；凝胶成像系统(美国BIOTek Ettan Dige Imager)；Axygen琼脂糖凝胶回收试剂盒；超微量分光光度计(美国QuaWellQ5000型)；全温型多振幅高速轨道摇床(上海智城ZHWY-200D)；荧光定量PCR仪(Gene Company Limited基因有限公司，德国P06213型)；微孔板离心机(杭州瑞诚仪器有限公司MPC2800型)。

1.3 引物的设计与合成在GenBank下载TBEV核苷酸序列并寻找NS5片段保守区，用Primer Premier 5.0 软件设计特异性荧光定量PCR引物，上游引物TBEV-NS5-F1：5′-AATGACTGGATTCTGGAA-3′，下游引物TBEV-NS5-R1：5′-GGATTTCACTTTCGCTAT-3′，扩增片段大小为84 bp，由长春库美基因科技有限公司合成。

1.4 TBEV标准品的制备以TBEV的cDNA为模板，上游引物TBEV-F：5′-CAGCAGCGAGTGTTCAARGA-3′；下游引物TBEV-R：5′-GGTCCTCATTCAAAAAGCCA-3′进行扩增；扩增片段大小为435 bp。反应体系 ：Ex-Taq Master Mix 0.2 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA sample 1 μL，ddH2O 17.3 μL，总体系 25 μL。反应条件为：94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，共35个循环，20℃保温。以PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将胶回收产物与pMD18-T载体连接，并转化到 DH5α 感受态细胞，于含氨苄青霉素的培养板37℃培养12 h，挑取单个菌落，摇菌14 h后进行菌液PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，设空白对照，观察结果，并将菌液PCR产物送往基因公司测序。提取质粒，采用紫外分光光度计测定D值，按照拷贝数计算公式计算重组质粒拷贝数，质粒拷贝数=质量浓度(mg/ L)×6.023×1014/(碱基数×660)。

1.5 反应条件的优化和标准曲线的建立以标准品为模板，按(108～101)拷贝/μL梯度稀释进行荧光定量PCR扩增。反应总体系20 μL，以TBEV-NS5-F1/ TBEV-NS5-R1作为引物分别为0.8 μL、 SYBR GreenⅡ荧光定量PCR反应液10 μL、质粒DNA 1 μL、去离子水补足至20 μL，在此基础上设阴性对照。因为退火的温度和时间对PCR反应的影响较大，所以本试验通过调节退火温度和时间来优化反应条件，反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60～ 65℃ 20～30 s；95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s，共40～50个循环。反应结束后标准曲线由荧光定量PCR仪自动生成，其中X轴代表每个梯度标准质粒DNA拷贝数的对数，Y轴代表每个梯度标准质粒DNA扩增的循环数。

1.6 敏感性检测在获得标准曲线后，以标准品作为模板，按(108～ 101拷贝/μL)梯度稀释，每个梯度重复做3次，进行荧光定量PCR检测，同时利用半巢式PCR对标准品进行检测，2种检测方法的扩增产物均进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，设空白对照。统计检出质粒DNA的最小拷贝数，比较2种检测方法的敏感性。

1.7 重复性检测利用建立的荧光定量PCR检测方法，以108～105拷贝/μL稀释浓度的标准品作为重复性检测的对象，每个梯度重复3次。根据计算公式以Cq值的大小算出这4个浓度标准品的变异系数，分析该方法的重复性。计算公式：C×V=(标准偏差s/平均值)×100%

1.8 特异性检测将淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)和TBEV毒株作为特异性检测的对象。利用建立的荧光定量PCR进行检测，分析该方法的特异性。

1.9 牛血清样品检测利用半巢式PCR和建立的荧光定量PCR检测方法对2017年5-7月在内蒙古地区采集的155份牛血清样品进行检测，比较分析两种检测方法的检测结果，并将阳性样品送往长春库美基因科技有限公司进行测序。

2 结果

2.1 TBEV标准品的鉴定结果经PCR扩增反应，目的片段为435 bp，与预期片段大小一致(图1)。测序结果显示，TBEV目的基因克隆至pMD18-T载体，成功构建标准质粒，质粒质量浓度为197.14 mg/L。根据公式计算分子拷贝数为5.36×1010拷贝/μL，将其稀释536倍至108拷贝/μL。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化结果反应体系20 μL：上、下游引物各0.8 μL、SYBR GreenⅡ荧光定量PCR反应液10 μL、模板cDNA 1 μL，去离子水补足至20 μL，在此基础上设阴性对照。反应条件：95℃ 30 s 、95℃ 5 s 、60℃ 30 s 、95℃ 15 s 、60℃ 30 s 、95℃ 15 s，共40 个循环。

图1 标准品的鉴定 1.PCR扩增产物；2.阴性对照；M.D2000 DNA Marker

2.3 标准曲线的建立结果将标准品按10倍倍比稀释，以8个稀释梯度(108～ 101拷贝/μL)进行荧光定量PCR扩增，显示标准曲线Ct值和标准质粒浓度间呈现良好的线性关系(图2,3)。标准曲线方程为Y=-3.3 logX+38.71，扩增效率97%。在83.1℃处出现单一的特异性峰，Tm值均一，未出现非特异性扩增。

2.4 敏感性检测结果荧光定量PCR检测下限为101拷贝/μL，半巢式PCR检测下限为102拷贝/μL，荧光定量PCR灵敏度比半巢式PCR高10倍，具有更好的敏感性(图4)。

2.5 重复性检测结果经过重复检测，建立方法变异系数低于2%，阴性对照无特异性扩增。表明建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性(表1)。

2.6 特异性检测结果用建立的荧光定量PCR方法检测LCMV、SFTSV和TBEV等蜱传病毒，发现TBEV能够产生特异性扩增，而LCMV和SFTSV均未扩增(图5)。表明建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性。

2.7 牛血清样品检测结果对155份牛血清样品检测结果显示，荧光定量PCR检测出阳性样品22份，阳性率为14.2%，半巢式PCR检测出阳性样品14份，阳性率为9.0%，两者一致率为63.6%(表2)。

3 讨论

蜱传脑炎病毒(TBEV)是黄病毒科黄病毒属的一种经蜱传播的带囊膜的单股正链RNA病毒。可导致患者高热、头痛、意识障碍、脑膜刺激征等症状，重者可导致死亡或留下严重后遗症，同时可导致牛羊等家畜出现精神萎靡、食欲不振、肢体麻痹等病症，给疫区人民的生产生活带来严重危害[2]。分子生物学检测方法通常具有敏感性高特异性好的优点，目前已有研究应用巢式PCR和荧光定量探针法对TBEV进行检测，考虑到巢氏PCR耗时较长，探针法荧光定量PCR探针合成成本高的缺点，本试验建立了基于SYBR GreenⅡ核酸染料的荧光定量PCR方法[8-9]。该方法不但稳定性好(组内变异系数<2%)，而且具有较高的敏感性(检测下限：101拷贝/μL)和特异性(对LCMV和SFTSV不产生特异性扩增)。

图2 荧光定量PCR标准曲线

图3 荧光定量PCR溶解曲线

图4 荧光定量PCR敏感性分析 A.荧光定量PCR;B(上).常规 PCR；B(下).半巢式PCR;1～8.108～101 copies/μL;9.对照；M.Marker

牛羊在蜱传脑炎传播循环中起着重要作用，在流行地区牛羊等家畜均存在森林脑炎病毒抗体，而且目前已有报道在牛奶和羊奶中检出TBEV，说明病毒可能会通过未煮熟的奶制品传播给人[12]。因此对牛、羊等放牧动物体内TBEV的检测对于病毒防控及食品安全具有重要意义。本试验利用建立的荧光定量PCR方法对155份牛血清进行检测验证，TBEV阳性率为14.2%，高于半巢式PCR阳性率9.0%，2种方法检测一致率为63.6%，荧光定量PCR检测效果优于半巢氏PCR。

本试验存在2个缺陷。首先，限于病毒模板问题，本试验在特异性检测验证上只检测了本实验室保种的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和发热伴血小板减少综合征病毒[10-11]，至于该方法对其他黄病毒或蜱传病毒是否有非特异性扩增并未得到验证，但是从引物序列比对上看，本试验所用引物仅能特异扩增TBEV；其次本试验只针对牛临床样品进行了检测，该法在人及其他动物样品检测上是否具有好的检测效果有待进一步试验验证。

表1 荧光定量PCR重复性检测结果

图5 荧光定量PCR特异性分析

表2 荧光定量PCR临床样品检测结果

综上所述，本试验成功建立了一种基于SYBR GreenⅡ的荧光定量PCR的TBEV检测方法，该法敏感性高、稳定性好、检测耗时短、成本低，为TBEV的诊断及防控提供了技术支持，为TBEV的流行病学监测奠定基础。