1株犬源PCV3的全基因克隆与序列分析

辛佳亮，汪 伟，杜 倩，韩知晓，闭璟珊，孔子荣，张书祥，孙文超，曹 亮，鲁会军，郑 敏，金宁一1,*

(1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530004；2.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530000；3.温州大学 病毒学研究所，浙江 温州 325035；4.军事医学科学院 军事兽医研究所，吉林 长春 130122)

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)是近年来发现的一种新型猪圆环病毒，属圆环病毒科圆环病毒属，是一种共价闭合、无包膜的单股环状DNA病毒[1]。该病毒全长 2 000 bp，包含3个主要的开放阅读框(opening reading frame,ORF)，分别是编码296个氨基酸组成的复制蛋白酶(replicase protein,Rep)的ORF1、编码214个氨基酸组成的衣壳蛋白(capsid protein,Cap)的ORF2和编码230个氨基酸组成的功能未知蛋白的ORF3[2]。

2016年，美国学者PALINSKI等[2]和PHAN等[3]从罹患心肌炎和多系统炎症的仔猪中发现PCV3。随后,在欧洲和亚洲各国的猪群中也相继发现了PCV3的存在[2-8]，并且可分为PCV3a和PCV3b等2个亚型[9-10]，这说明PCV3在世界范围内广泛存在。临床资料显示，PCV3可通过胎盘和精液进行传播[3,10]，不同年龄、性别和品种的猪群均可感染PCV3，但以妊娠母猪和仔猪最为易感[3,5]，主要表现为猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、母猪繁殖障碍(reprdouctive failure sows)和仔猪腹泻(piglet diarrhea)等问题[2-3,11]。研究发现，可从犬群中检测到PCV3[12]，这暗示着PCV3可能和PCV2同样具有跨物种传播的能力[13]。

为进一步确认PCV3能感染犬，并了解广西地区犬源PCV3毒株的流行情况及其分子特征、分析不同宿主及国内外PCV3毒株进化关系，本试验拟对广西多个地区采集的犬血清进行检测，以期为进一步开展PCV3病毒遗传进化、致病性研究以及跨种传播奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料由广西动物疫病预防控制中心采集并保存来源于广西防城港、玉林和百色3个地区的养殖场中的犬或散养家犬的血清，共计148份。

1.2 主要菌株、试剂和载体2×Taq PCR MasterMix、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、Maker Ⅲ、DNA纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化有限公司；Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂粉、琼脂糖、蛋白胨、酵母粉购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD-18T Simple Vector购自大连宝生物公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 病毒基因组提取根据天根的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒的方法，提取犬血清DNA，并于-20℃保存备用。

1.4 病毒检测和全基因组扩增根据GenBank中GX-920/2017(GenBank：MG253683.1)毒株序列，设计合成1对检测引物(JC-F/R)和2对扩增全长引物(PCV3-F/R)(表1)。引物均由生工生物工程股份有限公司公司合成。

1.4.125 μL检测反应体系及反应条件 反应体系如下：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，JC-F和JC-R各0.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 10.0 μL。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共30循环；72℃延伸10 min。扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.250 μL全长反应体系及反应条件 反应体系如下：2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL，PCV3-F和PCV3-R各1 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 20.0 μL。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，62℃退火50 s，72℃延伸2 min，共30循环；72℃延伸10 min。扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 PCV3 检测和全长引物

1.5 目的片段胶回收、克隆鉴定和测序使用DNA纯化回收试剂盒回收扩增的目的片段。将回收纯化后的DNA片段与pMD18-T Simple Vector连接并转化至Trans5α感受态细胞中。将转化菌液均匀涂布含有氨苄青霉素的LB平板培养12 h，挑取单个白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃、220 r/min的摇床中培养12 h。将培养的菌液按天根质粒小提试剂盒方法提取质粒，进行PCR鉴定。将鉴定结果为阳性的质粒送吉林库美生物有限公司测序。

1.6 序列分析应用DNAstar软件将获得的基因序列与NCBI公布的代表参考毒株 进行氨基酸序列和核苷酸序列比对。

1.7 系统进化分析利用MEGA7.0软件，使用Maximum Likelihood (ML) 法p-distance模式构建系统进化树，并进行基因分型。

2 结果

2.1 分子流行病学调查利用JC-F/JC-R引物对148份犬血清进行PCR扩增，目的片段为650 bp，发现其中36份为PCV3阳性样品，阳性率为24.3%，部分样品检测结果如下图所示(图1)。

图1 部分PCR检测结果 M.DL2000 DNA Marker;1.阳性对照;2.阴性对照;3～17.临床样品

2.2 基于基因组的序列分析选取1份阳性样品DNA经PCV3-1F/R和PCV3-2F/R等2对引物分别进行PCR扩增，目的片段分别为1 300 bp和1 100 bp(图2)。并对获得的目的片段进行回收，克隆和测序。利用DNAstar软件进行拼接。结果显示目的片段核苷酸序列长度为2 000 bp，将该毒株命名为PCV3/Guangxi-5 (GenBank：MH916639.1)。将PCV3/Guangxi-5 序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对，结果显示Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9%～100.0%，其中PCV3/Guangxi-5与DE27.16(GenBank：MG014370.1)株同源性最低，与PCV3/CN/Chongqing-148/2016(GenBank：KY075991.1))同源性最高(图3)。此外对ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现，第24至第27位氨基酸有6种形式，分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。

2.3 系统进化树分析

2.3.1基于ORF2基因的系统发育分析 基于ORF2基因的系统发育分析(图4A)，结果表明本试验获得的PCV3/Guangxi-5(GenBank：MH916639.1)为PCV3a亚型，与PCV3/CN/Liaoning-23/2016(GenBank：KY354060.1)亲缘关系最近。此外，本试验获得的犬源PCV3/Guangxi-5与NCBI公布的犬源CCV-A、CCV-B、CCV-C毒株不在同一基因亚型，这暗示PCV3毒株可能没有明显的物种差异。

2.3.2基于全基因组的系统进化分析 同样使用Maximum Likelihood (ML) 法p-distance模式构建基于全基因组序列的系统进化树(图4B)，结果显示本试验获得的PCV3毒株基因型为PCV3a，且与CN/chongqing-148/2016(GenBank：KY075991.1)亲缘关系较近，与CNFJ-1(GenBank：KY753912.1)等毒株亲缘性较远。

图2 目的片段PCR扩结果 M.DL2000 DNA Marker;1.PCV3-1F/R产物;2.PCV3-2F/R产物

图3 PCV3全基因组序列分析

3 讨论

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是一种环状、单链和无包膜的DNA病毒，是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的重要成员之一[14]。该病毒在2016年前被认为只存在2个基因型，即PCV1和PCV2[15-16]，其中PCV1被认为对动物没有致病性；PCV2则被认为与多种临床疾病相关。PCV2可引起患猪淋巴细胞和组织细胞凋亡[17]，出现免疫抑制问题[14]。虽然单独感染PCV2的临床症状轻微，但是当与其他病毒混合感染时，有利于其他病毒的感染和增殖，如与PRRSV、PRV、PPV等病毒混合感染出现PMWS症状[14]。此外在跨物种传播方面，PCV2已被证实可感染牛、羊和犬[18],具有跨种传播能力[19]。

图4 基于PCV3 ORF2基因的系统发育树

2016年美国学者从患病母猪和仔猪的体内检测到一种新型圆环病毒——猪圆环病毒3型(PCV3)[2-3]。自PCV3被正式报道以来，在欧洲和亚洲各国和地区也相继报道了PCV3感染的情况[4-8]，这表明PCV3在世界范围内广泛存在。对PCV3基因组研究发现PCV3具有和PCV1和PCV2相似的基因结构，均存在ORF1和ORF2等2个开放阅读框，2个阅读框分别编码ORF1(Rep)蛋白和ORF2(Cap)蛋白[2]。氨基酸序列比对分析发现PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸序列同源性仅为30%[11]，推测PCV2和PCV3相互之间不具有交叉保护的特性。但在跨物种传播方面，近期的一项研究令人十分惊讶。ZHANG等[12]从犬群中检测到PCV3，推测PCV3可能与PCV2类似，具备的跨种传播能力。

本试验对ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸进行比对分析发现，Cap蛋白的氨基酸位点突变主要集中在第24位至第27位氨基酸上，且有6种形式(VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK)。据报道，PCV2的ORF2编码的Cap发生变异可能导致新的变异毒株出现，虽然PCV3和PCV2的Cap蛋白同源性较低，但考虑Cap蛋白作为PCV主要结构蛋白，可诱导动物机体产生特异性免疫应答[20-23]，由此推测PCV3毒株的变异与其Cap蛋白氨基酸突变也可能存在一定关联。

结合氨基酸序列和系统进化树进行分析，发现第24至27位氨基酸序列为LRRK和VRRK的PCV3毒株主要集中在PCV3a中，氨基酸序列为ARRR，VRRR,ARKR,VRRR和一小部分VRRK的毒株集中在PCV3b，推测Cap蛋白的第24位至27位氨基酸的形式与基因型之间可能存在一定联系。此外，分析发现犬源PCV3毒株之间的同源性并不是最高的，且PCV3/Guangxi-5与CCV-A、CCV-B、CCV-C处不同基因亚型，这暗示PCV3毒株可能没有明显的物种差异。

综上所述，本试验从犬血清样品中检测到PCV3的基因组，证实了广西地区的犬群中已经存在PCV3感染的情况，并完成1株犬源PCV3的全基因序列测定，理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料，为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据。