藜蒿叶中总黄酮提取工艺优化

杨凌君，苏银燕，赵奕敏，王琤韡

（江西科技师范大学生命科学学院，南昌 330013）

藜蒿，又名艾蒿、蒌蒿、芦蒿等，为菊科属多年生草本植物，以根茎和嫩茎供食用，营养丰富，可凉拌或炒食，作为鄱阳湖一种特色时令蔬菜，深受大家喜欢。研究表明，被丢弃的藜蒿叶和老茎中含有丰富的黄酮类化合物和活性多糖等天然活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗突变、抗衰老等广泛的药理作用[1-3]。黄酮类化合物的提取方法主要有热水浸提、醇法提取、微波辅助提取以及超声辅助提取等[4]。由于醇法提取具有过程简单，研究成本低，利用率高等优点，因此本实验选取醇法提取鄱阳湖野生藜蒿叶中的黄酮类化合物，通过实验找出黄酮类化合物醇法提取的最佳工艺条件，为藜蒿叶中黄酮类化合物的高效提取提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、仪器

野生藜蒿叶采摘自鄱阳湖，经挑选、分类、洗净沥干，低温烘干至恒重，超微粉碎后过80目筛；芦丁标准品购买于合肥博美生物科技有限责任公司。

无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水等所有试剂均为分析纯，购买于西陇科学股份有限公司。

电子天平（ES2000），天津市德安特传感技术有限公司；电热鼓风恒温干燥箱（DHG-9015A），上海一恒科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（DK-S26），上海精宏实验设备有限公司；722N可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；回流装置。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮标准液的制备

芦丁标准液（准确称取0.010g芦丁置于50mL容量瓶中，以60%乙醇溶解定容，取25mL定容后的溶液用蒸馏水稀释至50mL，即芦丁浓度为0.1mg/mL）。制备过程：准备7 支有编号标签的25mL的试管（0、1、2、3、4、5、6号），准确量取芦丁标准液0、1、2、3、4、5、6mL分别加入试管中，向每支试管中加入30%乙醇溶液5mL、5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min后再加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，最后加入4%氢氧化钠溶液4mL，用蒸馏水稀释至25mL，放置25min 后在紫外分光光度计上设定波长510nm 处测定各试管中溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，溶液浓度（μg/mL）为横坐标，绘制出标准曲线图。芦丁浓度与吸光度呈线性关系，相关系数r=0.9982，线性回归方程y=0.011x+0.0027，满足测定要求。

1.2.2 藜蒿叶总黄酮的制备

将新鲜摘的藜蒿取叶洗净在鼓风干燥箱内60℃下烘干至恒重，超微粉碎后过80目筛得到样品粉末。准确称取经处理后的藜蒿叶样品粉末1.000g 置于25mL 圆底烧瓶中，加入一定体积的70%乙醇溶液浸泡1h后，放入一定温度恒温水浴锅中回流提取一定时间后，得到的提取液用滤纸过滤定容至25mL 作为样品液备用。制备过程：准备1支25mL的试管，准确量取样品液1mL加入试管中，向试管中加入30%乙醇溶液5mL、5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min后再加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，最后加入4%氢氧化钠溶液4mL，用蒸馏水稀释至25mL，放置25min后在紫外分光光度计上设定波长510nm处测定试管中溶液的吸光度。利用线性回归方程计算藜蒿叶中总黄酮得提取率（其中每组实验均做3 组重复，下列表中总黄酮得率所代表的数值为3个重复组的平均数）。计算公式：

m1=xV×稀释倍数

藜蒿叶总黄酮提取率=m1/m2×100%

式中，y 为吸光度；x 为浓度；m1为黄酮的质量；m2为藜蒿叶样品粉末的质量；V为最初定容的体积。

1.2.3 藜蒿叶总黄酮提取率的影响

1.2.3.1 单因素对藜蒿叶总黄酮提取率的影响

单因素实验中以藜蒿叶粉末质量（1g）不变的情况下，设置各元素之间变量与不变量的关系，进行研究分析不同变量对藜蒿叶总黄酮提取率的影响。设提取温度70℃、提取时间1.5h为不变量，研究分析不同液固比（5、10、15、20、25mL/g）对藜蒿叶总黄酮提取率的影响；设液固比20mL/g、提取时间1.5h为不变量，研究分析不同提取温度（40、50、60、70、80℃）对藜蒿叶总黄酮提取率的影响；设液固比20mL/g、提取温度70℃为不变量，研究分析不同提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5h）对藜蒿叶总黄酮提取率的影响。

1.2.3.2 藜蒿叶总黄酮提取工艺正交实验设计

以液固比、提取温度、提取时间3个选项进行L9（33）正交实验设计（通过单因素实验结果选定3个不同提取水平进行正交实验见表1）。通过正交实验确定藜蒿叶总黄酮提取的最佳工艺组合。

表1 提取藜蒿叶总黄酮的正交实验

1.3 数据分析

使用Excel 2010 软件进行数据输入，用Spss18.0软件处理数据并进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

不同因素及不同提取水平下藜蒿叶中总黄酮提取率见表2。由表2 可知总黄酮提取率随着液固比、提取温度和提取时间的增加均呈现先上升后下降的趋势，其中在液固比为10mL/g时总黄酮提取率出现显著差异（P＜0.05），而总黄酮提取率受提取温度和提取时间的影响较小，组间差异不显著（P＞0.05）。在液固比为20mL/g 时总黄酮提取率最高为3.031%，提取温度为70℃时总黄酮提取率最高为2.901%，提取时间为1.5h时总黄酮提取率最高为2.786%。

表2 不同因素及不同提取水平下藜蒿叶总黄酮提取率

2.2 正交实验

正交实验的设计方案以及实验结果见表3。由表3可知藜蒿叶总黄酮提取的最佳提取组合为A2B1C2。由表3 中R 值可知藜蒿叶总黄酮提取率的影响大小因素依次是A＞B＞C，即液固比大于提取温度大于提取时间。在表3中提取率最高的组合为A2B1C2，提取率为3.960%即液固比15mL/g、提取温度60℃、提取时间1.5h。在表3 中由K 值可知藜蒿叶总黄酮的最佳提取工艺组合为A2B1C2。

表3 藜蒿叶总黄酮测定的正交实验结果

藜蒿叶中总黄酮提取的方差分析结果见表4。由表4中F值可知FA＞FB＞FC，F值的大小可以判断出各因素对藜蒿叶总黄酮提取率的影响大小，由结果可知每个因素对提取率的影响都不同，影响大小依次是液固比、提取温度、提取时间，其中液固比对藜蒿叶中总黄酮提取率的影响显著。

表4 藜蒿叶中总黄酮提取的方差分析结果

3 讨论

3.1 单因素实验对藜蒿叶总黄酮提取率的影响

3.1.1 液固比对藜蒿叶总黄酮提取率的影响

以液固比为变量（5、10、15、20、25mL/g），而其他条件均为固定量（提取温度70℃，提取时间为1.5h）进行总黄酮提取的单因素实验（见图1）。由图1可以看出液固比在5～20mL/g时，藜蒿叶中总黄酮的提取率逐渐升高。可能原因是当液固比较低时液体量不足，不能充分浸泡藜蒿叶粉末，导致总黄酮的提取不完全；当继续增大液体量时，提取已较为完全，变化趋势波动不大；当液固比太大时，溶剂用量大，体系升温速率变慢从而影响提取效果使得提取率降低。所以液固比在20mL/g时总黄酮的提取率最高为3.031%。

图1 液固比对藜蒿叶总黄酮提取的影响

3.1.2 提取温度对藜蒿叶总黄酮提取率的影响

以提取温度为变量（40、50、60、70、80℃），而其他条件均为固定量（液固比20mL/g，提取时间为1.5h）进行总黄酮提取的单因素实验（见图2）。由图2 可以看出提取温度在40～70℃时藜蒿叶总黄酮的提取率不断增高。可能原因是温度升高，分子运动剧烈，加快了总黄酮的溶出，增大了提取率；温度过高时，由于黄酮类化合物有一定的热敏性导致其分子结构被破坏而分解，使得提取率下降。所以提取温度在70℃时总黄酮的提取率最高为2.901%。

图2 提取温度对藜蒿叶总黄酮提取的影响

3.1.3 提取时间对藜蒿叶总黄酮提取率的影响

以提取时间为变量（0.5、1、1.5、2、2.5h），而其他条件均为固定量（液固比20mL/g，提取温度为70℃）进行总黄酮提取的单因素实验（见图3）。由图3可以看出提取时间在0.5～1.5h时藜蒿叶总黄酮的提取率不断增高。可能原因是提取时间过短，总黄酮不能充分溶出致使提取率较低；提取时间过长时，总黄酮受热时间长，其中主要成分部分发生热分解损失，造成提取率的下降。所以提取温度在1.5h时总黄酮的提取率最高为2.786%。

图3 提取时间对藜蒿叶总黄酮提取的影响

3.2 正交实验对藜蒿叶总黄酮提取率的影响

由正交实验结果可知藜蒿叶中提取总黄酮的最佳提取条件是液固比15mL/g、提取温度60℃、提取时间1.5h，而单因素实验结果中显示当液固比为变量时，液固比为20mL/g总黄酮提取率最大；提取温度为变量时，提取温度为70℃总黄酮提取率最大；提取时间为变量时，提取时间为1.5h 总黄酮提取率最大。经过两种实验结果对比，发现单因素实验最佳提取条件与正交实验最佳提取条件不完全符合，可能原因是针对藜蒿叶中提取总黄酮而言不同因素之间存在相互影响作用。

4 结论

藜蒿作为大家喜爱的一种鄱阳湖特色时令蔬菜，主要食用其茎，而叶被丢弃造成一种浪费，所以本实验通过乙醇回流法对藜蒿叶中总黄酮进行提取并研究探讨了提取工艺的优化。经实验测得在液固比15mL/g、提取温度60℃、提取时间1.5h 的条件下藜蒿叶中总黄酮得率最高为3.960%，且液固比对藜蒿叶中总黄酮提取率有显著影响。