沉默CDK6 对人卵巢癌细胞增殖和粘附的影响
2020-05-18段丽王莉莉颜莹王冠邢焱玲孙杰
段丽 王莉莉 颜莹 王冠 邢焱玲 孙杰
卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，由于其发病隐匿﹑无早期临床表现，并且缺乏有效的早期筛查和诊断方法，死亡率在妇科恶性肿瘤中高居首位。卵巢癌的治疗手段主要是手术辅助化疗和放疗，近年，卵巢癌的治疗方法正在突飞猛进地发展，但卵巢癌的死亡率在妇科恶性肿瘤中仍居高不下。因此，发现有效治疗卵巢癌的新型靶点成为迫切需要。
细胞周期的异常调控导致细胞过度增殖是人类肿瘤发生的重要原因之一，与肿瘤的发生密切相关[1-2]。其中，细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶6（cyclin-dependent kinases，CDK6）是哺乳动物细胞关键的细胞周期重要调控因子[3]。CDK6在人类大多数肿瘤中过度激活。研究表明胃癌﹑肝癌﹑前列腺癌中均过表达，也有研究显示CDK6 在早期卵巢癌中表达促进了早期卵巢癌发生发展[4]。本论文拟采用RNA干扰技术，探讨靶向抑制CDK6基因后对人卵巢癌细胞增殖和粘附能力的改变，为卵巢癌靶向基因治疗提供了实验基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料
人卵巢癌HO-8910传代细胞株购买自哈尔滨医科大学第二附属医院中心实验室。CDK6基因的shRNA表达载体由兽医生物技术国家重点实验室保存，CDK6及β-actin引物由上海吉玛制药有限公司设计﹑合成。荧光RT-PCR试剂盒购自美国AB公司，FuGENE HD转染试剂盒购自德国Roche公司。其它试剂均为进口分装或国产分析纯。本研究经过黑龙江省医院伦理委员会批准。
1.2 研究方法
本实验室构建5条特异性shRNA和一条阴性对照（无关序列），由上海吉玛制药技术公司设计。将处于对数生长期的卵巢癌HO-8910细胞以每孔5×l05的密度接种24孔培养板。按Roche转染试剂盒说明书操作。实验共分7组：Ⅰ空白对照组（未转染组）﹑Ⅱ无关序列转染对照组（shNC组）﹑阳性转染组（ⅢshRNA-264组﹑ⅣshRNA-347组﹑ⅤshRNA-608组﹑ⅥshRNA-775组﹑ⅦshRNA-818组）。转染后36 h﹑48 h和60 h时分别收集提取各组细胞的总RNA。应用半定量RT-PCR技术检测CDK6 mRNA水平，结果显示在各组转染后48 h抑制率最高，其中CDK6-shRNA-608的抑制作用最强。因此选择检测CDK6-shRNA-608干扰后48 h对HO-8910细胞增殖和粘附能力的影响。
1.2.1 MTT实验检测细胞增殖能力 实验分为3组：Ⅰ空白对照组（未转染组）﹑Ⅱ无关序列转染对照组﹑ⅢshRNA-608转染组。转染后将各组细胞制备成5×105mL-1浓度的单细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板，每组细胞重复4孔。置于37℃﹑5%CO2的培养箱中培养。培养48 h后每孔加20 μLMTT（5 mg/mL，Sigma），继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，适度振荡10 min，充分溶解结晶。调节酶标仪波长为490 nm进行检测，OD值反映细胞的增殖情况。
1.2.2 细胞-Matrigel基质粘附实验 根据BD公司Matrigel使用说明书进行。96孔培养板中每孔加入16 μL Matrigel，置37℃﹑5%CO2的培养箱中孵育l h，PBS液洗2遍，加入200μL 0.1%BSA，37℃孵育2 h，PBS液洗2遍。转染后48 h，用胰酶消化各组细胞后以5×105mL-1浓度接种于包被Matrigel的培养板，37℃﹑5%CO2培养1 h后，用PBS液清洗未粘附的细胞2次，每孔加入100 μL含0.1%BSA的DMEM培养液和20 μL的MTT（5 mg/mL），继续培养4 h后，弃去孔中液体，加入120 μL DMSO，振荡10 min，充分溶解结晶。检测490 nm OD值。
1.3 观察指标
转染前后细胞内CDK6 mRNA的表达变化。通过检测平均光吸收值（OD值）来反映转染shRNA-608后48小时HO-8910细胞的增殖和粘附能力。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，2组数据比较采用非配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对细胞增殖能力影响的检测结果
利用MTT法检测OD490值来反映转染shRNA-608后48小时HO-8910细胞的增殖能力。结果显示，CDK6-shRNA-608转染组的OD值明显低于无关序列转染组和空白对照组，表明CDK6-shRNA-608转染组的细胞数量﹑增殖活性明显低于其他两组，差异显著，具有统计学意义（P=0.0003，P＜0.05）。而无关序列转染组和空白对照组之间差异无统计学意义（P=0.085，P＞0.05）。详见表1。
2.2 对细胞粘附能力影响的检测结果
应用MTT法测定与Matrigel基质粘着的三组细胞的OD值以检测转染shRNA-608后48小时HO-8910细胞的粘附能力。结果显示CDK6-shRNA-608转染组的OD值明显低于无关序列转染组和空白对照组，表明shRNA-608可显著抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖，CDK6-shRNA-608转染卵巢癌HO-8910细胞后，其与基质的粘附能力显著降低，差异显著，具有统计学意义（P=0.0004，P＜0.05）。而无关序列转染组和空白对照组之间差异无统计学意义（P=0.137，P＞0.05）。详见表1。
3 讨论
卵巢癌以发病隐匿﹑无早期临床表现﹑缺乏有效的早期筛查和诊断方法而成为女性重要的生殖系统恶性肿瘤。多数患者在晚期时才被发现，死亡率高，经过肿瘤细胞减灭术以及术后辅以化疗后，部分患者出现病情缓解，但一部分患者表现出化疗耐药和病情进展或者复发。阐明卵巢癌的发生﹑发展机制，采用针对性的药物治疗﹑寻求有效的药物治疗靶点，成为科研人员关注的热点问题。
研究发现，多种肿瘤均存在CDK6基因扩增﹑过表达或CDK6活性增强，包括鼻咽癌﹑膀胱癌﹑胰腺癌﹑食道癌和粘液纤维肉瘤等肿瘤[5-7]。进入21世纪以来，利用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）进行人类疾病的治疗已受到极大关注，包括病毒感染性疾病和肿瘤治疗[8-9]。siRNA可以通过RNAi效应特异性地沉默靶向基因，shRNA是具有发夹结构的siRNA前体，将人工设计合成的shRNA的模板DNA分子通过质粒转入细胞，在细胞内转录出shRNA可用于癌症的治疗[10-12]。本研究也同样使用shRNA技术研究干扰CDK6基因对卵巢癌细胞HO-8910增殖和粘附能力的影响，初步证实shRNA可靶向沉默CDK6基因，进而显著降低卵巢癌细胞的增殖和粘附能力。
表1 CDK6 shRNA 对人卵巢癌HO8910 细胞增殖和粘附影响检测结果
综上所述，沉默CDK6基因可抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖和粘附能力。CDK6与肿瘤的发生密切相关，有望作为肿瘤治疗的靶点之一。
