橄榄盐胚表层析出物形成影响因素的研究

丘金辉 ， 邱建清 ， 周美龄 ， 刘清培 ， 曾绍校 *， 林少玲

（1.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350000；2.福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室，福建福州 350000；3.福州大世界橄榄有限公司，福建 福州350002）

橄榄[Canarium album（Lour.）Raeusch]，也称作青果或白榄，是著名的热带、亚热带特产果品之一[1]，迄今已有两千多年历史。分布在中国的橄榄属植物主要有7种，其中成熟果实为黄绿色的普通橄榄（福建）和果实成熟显紫黑色的乌榄（广东）[2-3]是人工种植最多的橄榄属植物。福建省和广东省是中国橄榄的主要产区[4]，其中福建闽侯素有“中国橄榄之乡”的美誉[5]。橄榄蜜饯是橄榄加工的主要产品，传统的橄榄蜜饯加工都有盐渍工序，但自2008年国标规定禁止橄榄蜜饯生产中使用明矾后，橄榄在盐渍过程中表层极易析出一层灰白色物质，并会带入橄榄蜜饯终产品中，严重影响产品的外观品质和消费者的购买欲望。

果蔬在加工或贮藏过程中极易产生内源性析出物，表现形式主要为液体的沉淀析出物和固体表面附着物两种。果蔬的内源性析出物的产生，不仅降低了产品的感官品质及商业价值，还会影响人们对营养物质的吸收。食品中内源性析出物一直是国内外研究的重点与难点，对食品内源性析出物的形成机理的分析研究是探索其控制技术的必不可少的环节之一。目前，国内外关于食品中内源性析出物的相关研究主要集中在苹果、橙子、胡萝卜等常见果蔬产品析出物、茶饮料和酒类沉淀析出物等方面[6]。有研究表明果蔬表层析出物主要是由于多酚及蛋白质等大分子相互作用引起，而影响多酚、蛋白质相互作用的因素主要包括多酚、蛋白质浓度及种类、pH、温度、化学试剂（盐、乙醇等）、氧气等[7-8]。

作者比较“饶平”、“惠圆”、“长营”3 种橄榄的基本化学成分、矿质元素、多酚及可溶性蛋白质含量，分析析出物的前体物质；进一步分析橄榄多酚及可溶性蛋白与析出物的相关性和橄榄蜜饯盐渍过程中pH、盐（氯化钠、氯化钙及焦亚硫酸钠）等外部环境因素对析出物形成的影响，探究析出物（浊度）与盐渍液中多酚、可溶性蛋白的变化规律，为控制析出物提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜橄榄：福建省福州大世界橄榄有限公司提供；牛血清白蛋白：购自Solarbio公司；考马斯亮蓝G-250：购自Beyotime公司；硫酸、焦亚硫酸钠等常规试剂均为分析纯级（AR）。

1.2 主要仪器

SX2-12-12型马弗炉：上海雷韵实验仪器制造有限公司产品；HR2104型多功能搅拌机：荷兰皇家飞利浦电子公司产品；SKD-2000型自动凯式定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司产品；DK-S24型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司产品；WGZ-100型散射式光电浊度仪：上海精密仪器厂产品；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 橄榄样品的前处理 挑选新鲜程度和个头一致、中后期的“饶平”、“长营”、“惠圆”橄榄，清洗，每个品种的橄榄各自均分为两部分，一部分去核，只留果肉和果皮；另一部分分离果皮与果肉后去核，得到无皮果肉和果皮。最后分别用果蔬搅拌机破碎并做好标记置于-20℃冰箱中冷冻保存。

1.3.2 橄榄基本化学成分的测定 橄榄水分的测定：参照GB5009.3-2010；橄榄灰分的测定：参照GB5009.4-2010；橄榄蛋白质的测定：参照

GB5009.5-2010；橄榄脂肪的测定：参照GB/T 5009.6-2003；橄榄淀粉的测定：参照GB/T 5009.9-2008；橄榄总酸的测定：参照GB/T 12456-2008；橄榄总糖的测定 采用蒽酮比色法[1]。

1.3.3 橄榄矿质元素的测定 用质量分数1%的硝酸溶液将 K、Ca、Na、Mg、Zn、Fe、Cu、Al和 Mn 标准储备液（1 mg/mL）配置成 1 μg/mL 的 K、Ca、Na、Mg、Fe及 0.1 μg/mL 的 Cu，Zn、Al、Ba 的混合标准液。 称取0.100 0 g样品于消解罐，加浓HNO3冷消解48 h，再微波消解完全，用电炉蒸发至近干，得到的消化产物用质量分数2%的硝酸溶解并定容于50 mL的聚四氟乙烯材质的容量瓶。再按上述流程做空白对照。按表1的ICP-MS的工作条件参数测定预处理的样品。

表1 ICP-MS工作条件参数Table 1 Operating condition of the ICP-MS

1.3.4 多酚的测定 参照王振宇等[9]的方法，称1～2g的样品于100 mL三角瓶，加入10倍体积的石油醚（30～60℃）去色素脱脂，再加体积分数40%丙酮达到1 g∶40 mL料液质量体积比，封口，摇1 min后在超声清洗器（100 W，40℃）中处理60 min，取出倒出上清液并加入与第一次等体积的40%丙酮，再次提取，将两次的提取液以及未溶解的物质合并到离心管中，常温下4 200 r/min离心20 min，将上清液稀释50倍，测765 nm处的吸光度。根据谢倩等[10-12]的多酚测定方法绘制没食子酸标准曲线得到样品多酚含量。

1.3.5 可溶性蛋白质的测定 称样3～4 g，加25 mL去离子水并于超声波清洗机中处理60 min，设置参数为100 W，40℃，倒出上清液，再加入等量的去离子水再次提取，将2次提取液和未溶解的物质一起倒入离心管，4 200 r/min离心20 min，取上清液。再吸取 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的 1 mg/mL 牛血清白蛋白标准溶液于试管，分别加去离子水至2.0 mL。在另7支试管中各加0.1 mL以上溶液与5.0 mL考马斯亮蓝G-250，充分振荡后静置10 min，以第1管为对照，测595 nm处吸光值，绘制标准曲线。然后取样液0.1 mL于试管中，重复以上操作。

1.3.6 橄榄盐胚浊度测定 从盐渍容器的上中下各取2颗橄榄，用去离子水轻轻冲洗掉表面食盐，然后用200 mL离子水搓洗6颗橄榄表面，直至将肉眼可见的表面白色斑点，然后将溶液稀释合适倍数，最后测定浊度。浊度越大表示析出物越多，橄榄盐胚的稳定性越差；反之，则稳定性越好。浊度按以下公式计算：

式中：T为最终浊度 （NTU）；T1为溶液的测定浊度（NTU）；N为溶液稀释倍数；T0为纯溶剂的初始浊度（NTU）。

1.3.7 橄榄多酚与可溶性蛋白质对析出物形成的影响 配置含177.8 g/L氯化钠、2.5 g/L氯化钙及12.5 g/L焦亚硫酸钠的共混盐渍液。将橄榄与盐渍液1∶1倒入带盖PC桶，置于室温，第2～3天调节盐度至240.8 g/L，每2周测定橄榄盐胚及盐渍液的浊度、多酚及可溶性蛋白质含量。盐渍液浊度测定参照1.3.6的方法。

1.3.8 不同盐渍环境因素对析出物形成的影响

1）盐渍pH对析出物形成的影响 配置1.3.7中的共混盐渍液，用0.l mol/L的HCl和0.l mol/L NaOH溶液调节盐渍液pH值。将橄榄与盐渍液按质量体积比1 g∶1 mL倒入带盖PC桶，置于室温，第2～3天调节盐质量浓度至240.8 g/L，每2周测定橄榄盐胚的浊度。

2）氯化钠质量浓度对析出物形成的影响 配置含2.5 g/L氯化钙及12.5 g/L焦亚硫酸钠的共混盐渍液，加氯化钠，使氯化钠在共混溶液中的初始质量浓度分别为 133.6、155.9、177.8、209.7 g/L。将橄榄与盐渍液按1 g∶1 mL倒入带盖PC桶，置于室温，第 2～3天调节盐质量浓度分别至 217.5、229.1、240.8、252.7 g/L，每2周测定橄榄盐胚的浊度。

3）焦亚硫酸钠质量浓度对析出物形成的影响配置质量浓度177.8 g/L氯化钠及2.5 g/L氯化钙的共混盐渍液，加入焦亚硫酸钠，使焦亚硫酸钠在共混溶液中的质量浓度分别为 10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/L。将橄榄与盐渍液按1 g∶1 mL倒入带盖PC桶，置于室温，第2～3天调节盐质量浓度至240.8 g/L，每2周测定橄榄盐胚的浊度。

4）氯化钙质量浓度对析出物形成的影响 配置质量浓度177.8 g/L氯化钠及12.5 g/L焦亚硫酸钠的共混盐渍液，加入氯化钙，使氯化钙在共混溶液中的质量浓度分别为 0.00、1.5、2.5、3.5、4.5 g/L。将橄榄与盐渍液以1 g∶1 mL倒入带盖PC桶，置于室温，第2～3天调节盐质量浓度至240.8 g/L，每2周测定橄榄盐胚的浊度。

1.3.9 统计分析 所测结果均重复测定3次，取均值，试验数据用SPSS 13.0统计分析软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 橄榄盐胚表层析出物的前体物质分析

2.1.1 橄榄的基本化学成分分析 在盐渍过程中，“饶平”榄比“惠圆”和“长营”榄更易产生析出物。蛋白质是析出物的主要成分之一，但从表2中可以看出100 g“饶平”榄可食部分（未去皮的果肉）的蛋白质质量为（1.05±0.08） g，与“长营”蛋白质含量差异不显著，但显著低于“惠圆”，说明“饶平”榄并不是因其蛋白质质量分数较高而产生析出物。根据许多研究表明，参与内源性析出物形成的蛋白质主要为可溶性蛋白质[14]，推测析出物形成与蛋白质质量分数和种类有关。

表2 不同品种橄榄基本化学组成Table 2 Main nutrient compositions of different varieties of Canarmm album L

2.1.2 橄榄矿物质元素 虽有研究表明析出物的主要成分不是难溶性盐，但高价阳离子易与有机大分子络合形成更大的复合物，此外尤其多酚具有多个酚羟基，可以作为多基配合体络合金属离子，且不同金属离子与多酚的络合强度不等，络合强度为：Al3+＞Zn2+＞Fe3+＞Mg2+＞Ca2+[15]，因此，作者测定了 3种橄榄可食部分的矿质元素。从表3中可以看出新鲜橄榄K元素质量分数高，但未见报道称其能形成难溶络合物。同时，测定的可能与大分子络合形成复合物的金属元素中，Ca质量分数最高，其中 “饶平”榄Ca含量与“惠圆”水平相当，显著低于“长营”，表明橄榄本身矿质元素对析出物形成几乎没有影响或影响很小。

表3 不同品种橄榄矿质元素分析Table 3 Mineral compositions of different varieties of Canarmm album L

2.1.3 橄榄多酚与可溶性蛋白质质量分数

1）橄榄多酚质量分数 橄榄多酚是影响析出物生成的关键成分，从图1中可以看出，“饶平”榄果皮的多酚质量分数达（26.75±0.35）mg/g、可食部分（未去皮的果肉）及纯果肉的多酚质量分数也相对较高， 分别为 （18.02±0.54） mg/g、（12.61±0.41）mg/g，不论哪个部位的多酚质量分数都显著高于“惠圆”与“长营”；同时，任意品种橄榄，其果皮部位的多酚质量分数都显著高于可食部分及果肉。此外，“惠圆”的多酚质量分数整体稍高于“长营”，但“长营”果皮多酚质量分数反而比“惠圆”高。由此可见，橄榄多酚质量分数不仅与品种密切相关，也与其所在部位有关，可以通过去除橄榄果皮来控制析出物的形成。

2）橄榄可溶性蛋白质质量分数 目前，国内外关于食品中内源性析出物的相关研究主要集中在苹果、橙子、胡萝卜等常见果蔬产品析出物、茶饮料和酒类沉淀析出物等方面[6]。结果表明，许多果蔬沉淀析出物的形成都与其本身的可溶性蛋白质质量分数密切相关，表2显示“饶平”榄总蛋白质质量分数同“长营”相当，且显著低于“惠圆”，但从图2可以看出“饶平”榄可食部分及果肉的可溶性蛋白质质量分数显著高于“惠圆”与“长营”同部位可溶性蛋白质质量分数。

图1 不同品种橄榄的多酚质量分数Fig.1 Polyphenolcontentsofdifferentvarietiesof Canarmm album L

图2 不同品种橄榄可溶性蛋白质质量分数Fig.2 Soluble protein contents of different varieties of Canarmm album L

2.2 橄榄多酚及可溶性蛋白质与橄榄盐胚表层析出物的相关性分析

从表4可知，在橄榄盐胚贮藏期间，橄榄盐胚的多酚质量分数及可溶性蛋白质质量分数与盐胚浊度和盐渍液浊度呈极显著负相关；从表中还可看出，盐渍液中的多酚和可溶性蛋白质质量分数与橄榄盐胚浊度分别呈极显著正相关和显著正相关，盐渍液多酚与盐渍液浊度为显著正相关。因为在无氧条件下，多酚易通过氢键或疏水作用与可溶性蛋白形成可溶多酚-蛋白质复合物，并聚集可溶复合物形成不溶性化合物[16-17]，若存在氧气，则多酚会在多酚氧化酶作用下发生氧化反应，形成褐色聚合物[18]。

表4 橄榄盐胚各项指标间的相关分析Table 4 Correlation analysis between the indexes of salted Chinese olive and salted solution

2.3 盐渍环境因素对橄榄盐胚表层析出物的影响

2.3.1 pH对橄榄盐胚表层析出物的影响 图3为橄榄盐胚贮藏在不同pH值盐渍液中浊度的变化情况。由图可知，当盐渍液初始pH值为2.25、2.35及2.50时，其贮藏期间浊度变化很小，未出现表层析出物；盐渍液初始pH值为2.00及4.50时，出现了表层析出物；而盐渍液初始pH值为3.50时，橄榄盐胚在第4～6周时浊度增加最快，出现了表层析出物且程度最严重，其次是pH值为3.00时。pH影响WSSCO形成的机理是H+可以改变可溶性蛋白质的带电状态或所带静电荷数，从而影响蛋白质的疏水性，进而影响其与多酚的结合。以上结果说明pH值为3.00～3.50时多酚与蛋白质更容易相互作用形成沉淀析出物，这与綦菁华等多酚-蛋白相互作用影响因素的研究结果一致[7]。

图3 pH对橄榄盐胚浊度的影响Fig.3 Effect of pH on turbidity of WSSCO

2.3.2 氯化钠质量分数对析出物的影响 图4为搅打橄榄浸泡在初始盐度不同盐渍液中浊度的变化情况。由图可知，初始盐度不同盐渍液中橄榄盐胚浊度的变化趋势一致，即先逐渐上升，至第8周左右时趋于稳定。结果显示，橄榄盐胚浊度（即析出物）随着初始氯化钠质量分数的升高而降低。随着氯化钠质量分数升高，氯化钠渗入量及橄榄多酚及可溶性蛋白渗出量增加，而高质量分数氯化钠使得盐渍液中蛋白质发生盐析，从而降低了盐渍液中易与多酚结合的可溶性蛋白质含量。但初始盐质量分数过高易导致橄榄盐胚干瘪，因此，初始盐渍液达到质量分数19%时，橄榄盐胚开始出现皱缩。

2.3.3 焦亚硫酸钠质量分数对析出物的影响 随着焦亚硫酸钠质量分数的提高，橄榄盐胚浊度逐渐降低，当焦亚硫酸钠质量分数达到1.75%时，贮藏期间橄榄盐胚都未出现表层析出物（图5）。原因可能是：一方面，作为良好的抗氧化剂和多酚氧化酶抑制剂，焦亚硫酸钠可以有效防止盐渍液及橄榄盐胚中的多酚被氧化为邻苯醌，形成褐色聚合物；另一方面，由于焦亚硫酸钠可打断蛋白质分子中二硫键，降低了蛋白质间的交联度，改变了盐渍液中蛋白质结构，从而可能导致可溶性蛋白质含量降低[19]。

图4 氯化钠质量分数对橄榄盐胚浊度的影响Fig.4 Effect of sodium chloride concentration on turbidity of WSSCO

图5 焦亚硫酸钠质量分数对橄榄盐胚浊度的影响Fig.5 Effect of sodium sulfite concentration on turbidity of WSSCO

2.3.4 氯化钙质量分数对析出物的影响 图6结果显示，随着氯化钙质量分数的升高，橄榄盐胚浊度出现小幅度上升，说明盐渍液中氯化钙质量分数低于0.25%时对析出物影响很小，高浓度的Ca2+则会促进析出物的形成，这可能是由于Ca2+与多酚的酚羟基络合，形成低溶解度络合物有关[20]。

3 结语

橄榄成分分析表明，“饶平”榄可食部分中主要成分和矿质元素的含量与稳定性较强的 “惠圆”与“长营”相比差异很小；但“饶平”榄多酚与可溶性蛋白含量显著高于“惠圆”与“长营”，且同一品种橄榄不同部位的多酚与可溶性蛋白质含量差异显著。表明橄榄本身的矿质元素对析出物形成影响很小，析出物的前体物质主要是多酚与可溶性蛋白质。

图6 氯化钙质量分数对橄榄盐胚浊度的影响Fig.6 Effect of calcium chloride concentration on turbidity of WSSCO

橄榄盐胚贮藏过程中多酚及可溶性蛋白质含量与其浊度相关性表明，橄榄盐胚多酚及可溶性蛋白含量与橄榄盐胚浊度（表层析出物）及盐渍液浊度呈极显著负相关，盐渍液中多酚含量与橄榄盐胚浊度（表层析出物）及盐渍液浊度呈显著正相关；橄榄盐胚贮藏过程中多酚、可溶性蛋白质含量及浊度值的变化研究结果表明，析出物的形成主要是由于多酚与可溶性蛋白质相互作用所导致。

盐渍环境不同因素对析出物形成影响的研究表明盐渍液初始pH为2.25～2.50时，析出物最少；在初始pH为3.00～3.50的盐渍液中最容易形成表层析出物；随着氯化钠质量分数的增大，橄榄盐胚浊度呈降低趋势，但实际生产氯化钠初始质量分数一般超过19%；此外，结果显示Ca2+不是引起析出物的主要因素，适量的氯化钙可以提高橄榄盐胚的硬度，但过量的氯化钙对橄榄盐胚析出物的形成有一定的促进作用；当盐渍混合液中焦亚硫酸钠质量分数高于1.75%，橄榄盐胚未出现表层析出物。