仔猪H5N6亚型流感病毒与李氏杆菌混合感染病例

殷 茵 ， 赵永刚 ， 韩先杰

(1. 青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109 ； 2. 中国动物卫生与流行病学中心 ， 山东 青岛 266032)

2019年3月，潍坊市某养猪场的断奶仔猪出现高烧、神经症状、呼吸促迫等症状，持续半月余，断奶仔猪死亡率达30%。根据流行病学特点以及临床症状和病理变化，通过细菌和病毒两方面进行了病原检测，最终确诊为猪流感病毒和李氏杆菌混合感染导致发病和死亡。报告如下。

1 临床背景及剖检症状

猪场自繁自养，在断奶仔猪转入保育舍的阶段，群体出现高烧、呼吸促迫，以及后肢瘫痪、四肢呈现划水样等神经症状，外观可见流鼻液、耳尖等末梢处发绀、坏死，触诊可见腹股沟淋巴结肿胀。发病率可达50%以上，持续半月有余，死亡率约为30%。使用替米考星、强力霉素以及磺胺类药物等均未见效。猪场常规免疫伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪瘟疫苗。

剖检病死猪可见：下颌淋巴结严重充血肿大，腹股沟淋巴结充血肿大，喉头及气管内有黏液，心包积液，肺脏沿支气管分布有肉变现象，肝脏发黄有出血斑，脾脏肿大，肾脏无明显异常，膀胱积尿，脑膜充血。

2 主要材料

TSA、TSB培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；病毒核酸提取试剂盒、Taq酶，均购自宝生物工程 (大连) 有限公司；一步法RT-PCR试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；T5 DNA 聚合酶，购自北京擎科生物技术有限公司。

3 方法

3.1 细菌分离鉴定 按照生物安全无菌采集病死猪的肝脏组织于TSA平板划线，置于37 ℃培养24 h。 取单个菌落使用16S rDNA通用引物[1]进行PCR扩增，预期扩增片段大小为1 428 bp，产物送至青岛擎科生物技术有限公司测序，在线BLAST比对分析。

3.2 可疑病原的PCR和RT-PCR检测 无菌采集病死猪的肺、肝、淋巴结等组织，研磨后取上清提取核酸，参照国标方法分别进行流感病毒(GB/T 27521-2011)、猪瘟病毒(GB/T 16551-2008)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(GB/T 18090-2008)的RT-PCR检测和猪圆环病病毒(GB/T 21674-2008)、猪伪狂犬病病毒(农业部1485号公告-2-2010)、猪肺炎支原体(GB/T 35909-2018)的PCR检测。

3.3 流感病毒的亚型鉴定及遗传进化分析 使用A型流感病毒通用的全长扩增引物对组织中病毒的8个基因片段分别扩增，产物送至青岛擎科生物技术有限公司测序，NCBI网站在线BLAST比对分析。在GenBank中下载参考序列，使用MEGA 7.0软件对病毒的HA基因作遗传进化分析，用Clustal W方法比对，用Neighbor-Joining方法基于遗传距离构建系统发育进化树，Bootstrap值为1 000。使用DNA-STAR软件翻译和分析关键氨基酸位点。

4 结果

4.1 细菌分离鉴定 利用TSA平板从病死猪的肝脏中分离得到一种较小、光滑、圆形菌落，镜检为革兰阳性小杆菌，直或微弯，多数呈“V”字形排列。16S rDNA测序结果拼接比对后发现，其同源性最高的序列为产单核细胞李氏杆菌(序列号为FJ557241)，可确定分离菌为李氏杆菌。

4.2 可疑病原的PCR及RT-PCR检测 参照国标进行流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR扩增和猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒、猪肺炎支原体的PCR扩增,结果见图1，可知仅流感病毒扩增出与目的片段大小相符的229 bp的特异性条带，其他均无特异性扩增条带，说明病死猪有流感病毒的感染，但无其他病原感染。

图1 可疑病原的PCR及RT-PCR检测

4.3 流感病毒的亚型鉴定及遗传进化分析 经NCBI网站在线BLAST比对分析发现，检测病毒的HA基因和NA基因分别与A/chicken/Ganzhou/GZ21/2015(H5N6)和A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)同源性最高(同源性分别为98.24%和98.99%)，确定分离毒株为H5N6亚型流感病毒。由进化树分析可知，该病毒的HA基因属于2.3.4.4分支中的Group C(图2)。裂解位点的氨基酸为RERRRKRGLF，由多个连续的碱性氨基酸组成，符合高致病性流感病毒的特征。第225～228位受体结合位点为GQRG，具有结合禽类受体的特征。

图2 流感病毒HA基因系统发育进化树

5 讨论

猪是流感病毒重要的中间宿主，在我国很多猪群中存在不同程度的流感病毒感染[2]。通常猪流感单独发病时死亡率并不高，但是由于病毒侵袭机体后会损伤病猪的呼吸道，导致猪群的抵抗力降低，容易与其他病原诸如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、链球菌、李氏杆菌等混合感染，也会增加育肥猪的料肉比，造成严重的经济损失。目前在猪群中发现的流感病毒有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等亚型[3-5]，其中H3亚型是存在于我国猪群中的优势亚型[6-7]，H5亚型感染的猪流感并不多见[8]。

一般来说猪流感致死率并不高，但该猪场的哺乳仔猪病死率却达到了30%，经检测确定为流感病毒与李氏杆菌混合感染，仔猪除肺炎外还并发了脑膜炎，表现为高烧、流鼻液、呼吸促迫以及共济失调、后肢瘫痪等神经症状；另一方面，经HA基因裂解位点的分析发现，感染的H5N6亚型流感病毒为高致病性流感病毒株。此外，病理变化也具有一定的鉴定意义，猪感染流感病毒后肺脏的剖检病变表现为沿气管和支气管的肉样变，可与支原体所致的肺脏对称性肉样变加以鉴别。

本病例从发病仔猪检测到的H5N6亚型流感病毒的HA基因属于2.3.4.4分支中的Group C，与我国禽类当前流行的流感病毒属于同一分支。裂解位点的氨基酸符合高致病性流感病毒的特征，受体结合位点具有结合禽类受体的特征，推测可能是由禽类宿主传播到猪场。猪流感的意义不仅仅体现在养猪业的疫病防控上，我国目前还存在着相当一部分的散养户，部分地区为便于管理划定了养殖小区，猪和家禽往往被集中在同一片区域，如此虽然便于粪污处理和饲养管理，却增加了猪和家禽共患传染病—流感的传播风险。此前在猪群中也曾发现过H1N1、H5N1、H9N2、H6N6等几种禽流感病毒亚型[9-11]，说明这种猪禽混养的养殖模式可能会导致禽流感病毒从家禽传播到猪或人类。猪体内同时存在有人型的SA α-2,6 Gal受体和禽型的SA α-2,3 Gal受体，具有同时感染禽流感病毒和人流感病毒的能力，很早就有人认识到猪在流感病毒跨宿主传播过程中的“混合器”作用[12]。H5N6亚型流感病毒目前已经获得感染人的能力，且已导致多例患者死亡[13]，所以针对此类病原操作必须在符合生物安全条件的实验室进行。密切关注该病毒在猪群中的传播和进化情况具有深远的公共卫生意义。