运输应激对小鼠肾脏显微结构及热休克蛋白表达的影响

彭侃霖 ， 伍 钢 ， 吴青青 ， 王安平 ， 肖 鹏 ， 郑文亚,2,3

(1.宜春学院生命科学与资源环境学院 ， 江西 宜春 336000 ; 2.江西省高等学校硒农业工程技术研究中心 ， 江西 宜春 336000 ; 3.江西绿科农牧科技有限公司 ， 江西 宜春 336000)

随着国内畜禽养殖业的发展，朝着规模化、集约化迈进，大规模的畜禽运输已必不可少，但运输中应激反应会导致动物生产性能降低，如母畜流产，产奶量下降，动物源性食品的口感下降，如产生白肌肉(PSE肉)、黑干肉(DFD肉)，严重的应激反应甚至可导致动物死亡，这些都会给养殖场带来巨大的损失，因此降低运输过程中的应激反应已刻不容缓。

在动物运输过程中饥渴、高温、噪声会促进多种应激激素的分泌，降低机体免疫力，影响肾脏的功能。肾脏是水盐代谢的中心，具有保水、清除代谢产物、维持电解质平衡以及内分泌功能，保证机体内环境的稳定。运输过程中，肾脏生化反应异常进行，大量活性氧自由基通过氧化应激作用损伤肾脏[1]，影响机体的代谢水平。

热休克蛋白是动物体在应激原刺激下产生的一类在机体广泛分布且高度保守的蛋白质，它可折叠、组装、调节和降解蛋白质，在对抗环境压力方面发挥着重要的作用[2]。目前关于热休克蛋白家族的研究重点集中在热休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)27、70和90(HSP27、HSP70和HSP90)中，本试验以小鼠为实验动物，模拟运输应激对肾脏的损伤，探究HSP27、HSP70和HSP90三种热休克蛋白在小鼠肾脏的分布、表达量，为降低畜禽运输应激提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 运输应激模型的建立及处理方法 32只8～9周龄 的ICR雄鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，分为对照组和运输应激组，每组各16只， 处理前禁食限水，对照组于25 ℃下不处理，运输应激组则在35 ℃摇床160 r/min处理2 h，模拟夏季畜禽运输应激。应激处理结束后，处死小鼠，取小鼠肾脏，一部分于4%多聚甲醛中固定，另一部分迅速浸入液氮速冻待用[3]。

1.2 主要试剂 苏木精、伊红染液，均购自北京梦怡美生物科技有限公司；小鼠SP免疫组织化学检测试剂盒及浓缩型DAB，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；一抗HSP27(ab79868)、HSP70(ab5439)、HSP90(ab13492)和羊抗鼠酶标二抗(ab6789)，均购自Abcam公司；Mouse Anti-β-actin内参蛋白(BM0627)、彩色预染蛋白Marker(AR1113)，均购自博士德生物工程有限公司；4×Protein loading buffer(AI11800A)，购自TaKaRa Bio公司；HRP-ECL化学发光试剂盒(A149691)，购自GE Healthcare公司。

1.3 病理学观察 对在4%多聚甲醛溶液中放置48 h以上的组织块流水冲洗24 h以上，经脱水、透明、浸蜡、包埋后制备石蜡组织切片，37 ℃过夜后对切片进行H.E.染色，在光学显微镜下观察肾脏的病理学变化，做好记录并及时拍照。

1.4 免疫组织化学检测 切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精、微波抗原修复后，根据小鼠SP免疫组织化学试剂盒说明书进行操作，HSP27、HSP70、HSP90分别按照1∶800、1∶400和1∶800比例进行稀释，阴性对照用PBS代替一抗。DAB显色，苏木精染核，经过分化、返蓝、脱水、透明、封片后进行观察和拍照，有黄色或者棕色出现视为有阳性反应。

1.5 Western Blot检测 取肾脏经过研磨、蛋白裂解和抽提后制备蛋白提取液，采用BCA法测定总蛋白浓度，将对照组和运输应激组的总蛋白浓度调节一致。上样前制备好分离胶和浓缩胶，同时按比例往蛋白提取液中加入4×Protein loading buffer制成上样蛋白液，95 ℃变性蛋白10 min，每组加样孔按照对照组、运输应激组顺序上样，每次上样2组，进行SDS-PAGE凝胶电泳1.5 h，取凝胶孵PVDF膜湿转1 h，取膜用TBST漂洗后封闭2 h，将膜剪成适当大小后TBST漂洗3次，10 min/次，分别加入一抗[HSP27(1∶5 000稀释)、HSP70(1∶1 000稀释)和HSP90(1∶1 000稀释)]和内参蛋白(1∶500稀释)，在4 ℃垂直混合仪下孵育16～18 h，TBST漂洗3次， 10 min/次，二抗(1∶5 000稀释)孵育2 h，TBST漂洗3次，10 min/次。最后将PVDF膜按照HRP-ECL化学发光试剂盒的说明书用化学发光成像系统(Amersham Imager 600)进行成像、拍照。

1.6 图像与数据分析 用Image J软件对采集的图片进行分析，将目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值记为测试值。用SPSS 18.0软件进行数据分析，结果记为平均数±标准差，P<0.05表示差异显著，P>0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 运输应激小鼠肾脏的显微病理变化 与对照组(见中插彩版图1A)相比，运输应激组肾小管管腔狭窄，结构破坏，小管与小管之间的界限不清，部分小管之间发生融合，管状结构消失，上皮细胞发生弥漫性颗粒样变性，细胞排列疏松，间隔增大，胞核肿大，染色质浓缩、碎裂，细胞质出现大量细小颗粒乃至空泡化，管腔内可见粉红色物质(见中插彩版图1B)。肾间质淋巴细胞浸润，血管充血，少量红细胞渗出至组织中(见中插彩版图1C)。

2.2 运输应激对肾脏3种HSPs表达的影响 如中插彩版图2A、2B所示，HSP27蛋白在运输应激组肾小球系膜细胞、肾小囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质细胞有阳性反应，主要在胞质表达，对照组肾小囊壁层上皮细胞和肾小球系膜细胞无表达，其他部位表达情况与运输应激组相似。如中插彩版图2C、2D所示，HSP70蛋白在对照组和运输应激组肾小管上皮细胞胞质中均有表达，运输应激组在集合小管和远曲小管的表达明显要强于对照组，血管内皮细胞也有表达。见中插彩版图2E、2F所示，HSP90在运输应激组小鼠肾小球和肾小管无表达，而对照组肾小管有表达。

2.3 小鼠肾脏中3种HSPs在运输应激中表达量的变化 如图3所示，运输应激组和对照组HSP27蛋白表达量无显著差异(P>0.05)；运输应激组HSP70蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)；与对照组相比，运输应激组HSP90蛋白表达量明显下降(P<0.05)。

图3 小鼠肾脏中3种HSPs的表达量变化

3 讨论

在运输畜禽过程中，封闭的车厢内拥挤、湿热，动物容易脱水，抗利尿激素分泌增加，肾小管对水、钠的吸收增强，尿钠减少，体内代谢产物排出存在障碍，可能引起如代谢性酸中毒和氮质血症等疾病。此外运输过程中的高温、拥挤、噪声以及生活环境改变会促进肾上腺糖皮质激素大量分泌，机体血糖浓度应激性升高。有研究报道,在高糖条件下培养的肾小管上皮细胞株HK-2中，存在自噬障碍[4-5]。在高糖条件下，肾小管上皮细胞线粒体发生病变[6]，异常增多的ROS会导致肾小管上皮细胞发生凋亡[7-8]，而由于应激使得机体天然的抗氧化剂如抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-Px损耗严重，细胞对抗ROS能力下降[9]，导致肾小管结构被破坏[10]。本试验表明，模拟夏季畜禽运输应激会造成小鼠肾小管上皮细胞变性和坏死，间质充血和出血，淋巴细胞浸润，影响肾脏水盐代谢功能。

诱导型热休克蛋白70作为HSP70家族中的重要一员，被证实在肾小管和集合管的上皮有表达[11]。HSP70可抑制转化生长因子β，促使Smad2/3蛋白磷酸化并阻断其核移位，降低肾小管上皮间充质细胞异常转化率，使肾小管间质纤维化受到抑制[12-13]。在肾小管进行原尿重吸收时，其髓质部受到高渗环境胁迫，HSP70的表达量增加，增强了髓质细胞对高浓度细胞外盐的适应力，降低细胞在环境压力下发生变性甚至破坏的可能性[14-15]。此外，HSP70存在损伤抑制作用[16]，一方面HSP70可上调MEK/ERK信号通路，激活细胞外调节蛋白激酶磷酸化反应，抑制氧化应激反应[17]；另一方面HSP70可抑制应激激酶磷酸化，减少炎性细胞因子的合成，降低细胞凋亡[18]。这些研究充分说明，在对抗环境应激胁迫、抑制细胞凋亡和维持细胞正常功能方面，HSP70扮演了不可或缺的角色。本试验发现，HSP70在运输应激组小鼠肾脏的表达要显著高于对照组，这表明高水平的HSP70与机体维持正常水盐平衡有关。

HSP90在肾脏中主要分布在肾小管远端和集合管髓质段，通过协作机制逐步募集靶蛋白(如HSP70)并形成多伴侣复合物，这些复合物在应激条件下可调节信号转导并防止未折叠蛋白聚集[19-20]。HSP90还与一些病理反应有关，通过CD14/TLR2和CD14/TLR4受体复合物介导的信号转导途径诱导炎性细胞因子参与炎症反应[21]。本试验结果表明，在模拟运输过程中，与对照组相比，HSP90在小鼠肾脏的表达明显下降，这可能与高强度运输应激下HSP90的抑制作用有关。此外，在本试验中运输应激组和对照组HSP27的表达未出现显著差异，具体的机理还需要进一步的研究。

运输应激对小鼠肾脏特别是肾小管造成了较明显的病理损伤，这对维持水盐平衡具有消极影响，而HSP70表达上升，HSP90表达减弱，在一定程度上缓解这种影响，保持动物机体内环境稳定，降低运输应激对动物生产性能的影响。