1株灰鹦鹉源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及系统发育分析

徐 静 ， 冯永其 ， 段俊堂 ， 刘 蓬

(上海野生动物园 ， 上海 浦东 201399)

柠檬酸杆菌(Citrobacter)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，是发酵型革兰阴性菌，周身有鞭毛，无荚膜，无芽孢，广泛存在于土壤、水、食物等自然环境中，是水体污染的重要细菌学指标之一[1-3]。其中，弗氏柠檬酸杆菌常与人和动物的感染有关。弗氏柠檬酸杆菌是人和动物肠道内的正常菌群，并且也普遍存在于自然界中，是条件致病菌。近年来，不断有报道表明该菌可引起人和动物腹泻、肺炎及食物中毒等症状，能引起细菌性的系统败血症。本文报道了弗氏柠檬酸杆菌引起灰鹦鹉败血症的病例，为同行诊治提供参考。

1 发病情况

2019年5月17日，本园1只灰鹦鹉死亡，随即进行剖检诊断，发现其肝脏肿大，有散在出血点，肠道呈现大片出血。在无菌条件下，从灰鹦鹉心、肝、脾、肺、肾和肠道取样，划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上。

2 实验室诊断

2.1 细菌培养特征 各脏器培养均有细菌生长，且在哥伦比亚血琼脂平板上生长良好，菌落形态呈圆形、表面光滑、中间隆起、边缘整齐，有α溶血现象。挑选单个菌落进行纯化培养，并用鉴定培养基鉴定：在显色培养基麦康凯上为无色，S.S.琼脂上为黑色，伊红-美蓝上为铜黑色，中国蓝上为蓝色。革兰染色结果为革兰阴性，短杆状，两端钝圆，无芽孢。将此分离株命名为SH20190518。

2.2 细菌16S rDNA检测 将细菌分离株提取核酸，并进行16S rDNA鉴定。其PCR扩增在1 500 bp左右出现特异性条带，目的条带与预期大小一致(图1)。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

图1 16S rDNA PCR结果

2.3 测序结果比对 将细菌分离株SH20190518序列提交到NCBI上进行BLAST比对，结果显示，分离株16S rDNA与弗氏柠檬酸杆菌的相似度达到了97.97%以上。选取同源性较高的弗氏柠檬酸杆菌的16S rDNA基因序列作为内群；同时，选取沙门菌、大肠杆菌、志贺菌、肺炎克雷伯菌作为外群,利用MEGA 6.0 软件构建系统发育树。结果显示，分离株与弗氏柠檬酸杆菌聚为一类(图2)。综上所述，分离株SH20190518为弗氏柠檬酸杆菌。

2.4 药敏试验 按标准纸片琼脂扩散法对分离株进行药敏试验，结果显示，分离株对头孢克洛、头孢克肟高度敏感；对氧氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星中度敏感；对阿奇霉素、阿莫西林不敏感。

2.5 动物试验 用6～8周龄雌性的SPF BALB/c 小鼠进行细菌的毒力试验，分为腹腔注射组和空白对照组，每组3只，每只0.5 mL(细菌浓度为109CFU/mL)。 结果显示：空白对照组小鼠精神状态无异常；腹腔注射组3只小鼠于24 h内全部死亡，取其中1只小鼠进行剖检分析并进行脏器细菌培养。死亡小鼠心、肝、脾、肺、肾均出现不同程度出血、坏死，分离出的细菌形态与接种的弗氏柠檬酸杆菌形态一致，但是细菌出现β溶血现象。由此可见，分离株弗氏柠檬酸杆菌有一定的致病性，并且在小鼠体内复制后致病性增强。

图2 分离株系统进化树

3 讨论

笔者从患病的灰鹦鹉脏器中分离到1株细菌，基于该菌的形态学及16S rDNA基因序列分析，与弗氏柠檬酸杆菌的相似度达97.97%以上，确认该菌为弗氏柠檬酸杆菌。

弗氏柠檬酸杆菌属于肠杆菌科，该细菌主要引起呼吸道、消化道以及泌尿生殖道感染，尤其是在婴幼儿及免疫功能不全的人群中，可引起脑膜炎、脑脓肿及新生儿败血症等。2000—2012年，我国先后有5起弗氏柠檬酸杆菌引起人食源性中毒，进而发生严重腹泻的报道[4-6]。然而，弗氏柠檬酸杆菌对动物致病的重要性尚未确定。近年来，该菌引起鱼、鳖、虾、大鲵、蟹等水产动物感染发病的报道较多[7-9]。弗氏柠檬酸杆菌对水生动物的致病报道多于非水生动物，且对哺乳动物的感染主要集中在肠道内，对鸟类和爬行动物的感染主要在肠道外。2011年，Ewers等[10]报道了该菌对犬、猫、马和鹦鹉存在致病性。

有研究表明，弗氏柠檬酸杆菌的致病性与其脂多糖结构、耐药基因及致病基因有很大关系。严玉霖等[11]研究发现，内毒素为脂多糖中的主要毒力成分，可在细菌溶解或活跃繁殖时释放，并引起宿主免疫应答，危害人畜健康。周加利[12]发现，弗氏柠檬酸杆菌脂多糖中的O抗原种类对人和动物有很强的感染力，并且对内毒素的毒力作用有调控能力。本文根据分离株的药敏试验，对同群灰鹦鹉进行头孢菌素类药物预防，以减少动物死亡。小鼠毒力试验表明，分离株在小鼠体内复制后，毒力增强。因此，应当加强细菌的致病基因与其致病性之间的作用机理的研究。