医用外科口罩与一次性口罩防护能力比较研究

程 敏，温明新

（1.山东大学齐鲁医院，山东250012；2.山东大学基础医学院）

近10 年来，随着传染病的发病率持续升高[1‐4]，特别是呼吸系统传染病的多发[5‐7]，医务人员逐渐成为院内呼吸道传染病的高危人群。因呼吸系统传染病的传染源是病人或病原体携带者，通过飞沫经由呼吸道传播，传染性强，传播速度快[8‐9]，所以医务人员需要进行有效的自我防护。在这种情况下，口罩成为了医务人员最常用的防护工具[10]。目前医务人员常用的口罩有医用外科口罩和一次性口罩两种，而如何选择口罩，医务人员存在着一定的分歧。基于此，本研究期望通过实验能够证实两种口罩在防护能力上存在的区别，期望为医务人员提供确切的选择依据。现报告如下。

1 方法

1.1 细胞培养 人肺支气管上皮细胞（BEAS‐2B）选择DMEM 高糖培养基（10% 胎牛血清，1% 青链霉素），在孵育箱中，温度37 ℃，5%CO2的条件下培养。传代时先吸取上清，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗两遍，37 ℃，0.25%胰酶消化3 min，正常培养基终止消化，以1 000 r/min 离心5 min 后收集细胞，去掉上清，加入正常培养基，按照1∶3 传代。冻存液配方按照培养基：血清∶二甲基亚枫（DMSO）=5∶4∶1 配制。

1.2 条件培养基制备与分组 收集香烟烟雾的装置经过乙醇擦拭后，在生物安全柜中与香烟一起用紫外灯照射30 min 灭菌，烟雾收集后经过不同的口罩滤过后吹入BEAS‐2B 培养基中，并标注。根据培养基不同分为对照组（正常培养基）、一次性口罩组和医用外科口罩组。

1.3 噻唑蓝（MTT）实验 按照1 500个/孔，BEAS‐2B细胞接种在96 孔板中，加入正常培养基和条件培养基，每组6 个复孔，生长72 h 后，加入MTT，孵育箱培养4 h，取出去掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡5 min，酶标仪读取570 nm 波长的吸光度。

1.4 克隆形成实验 按照1 500 个/孔BEAS‐2B 细胞接种在6 孔板中，分别加入正常培养基和条件培养基，每组3 个复孔，正常培养；2 周后，取出培养板，去掉上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍，加入甲醇固定30 min，去掉甲醇，PBS 清洗2遍，加入考马斯亮蓝染色2 h，清水冲洗后晾干。

1.5 蛋白质提取 100 mm细胞培养皿培养的BEAS‐2B，在80%密度时，将培养皿置于冰上，吸掉上清液，PBS清洗2 遍，加入500 μL 强放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液静置5 min，细胞刮刀刮下转移至1.5 mL的EP管中，14 000 r/min，4 ℃离心15 min，上清液转移到新的1.5 mL EP管中，加入聚丙烯酰胺凝胶电泳（5xSDS‐PAGE）缓冲液稀释至1x，98 ℃加热5 min，分装，−20 ℃保存。

1.6 蛋白质印记法（Western blot） 配制12% 分离胶，6%浓缩胶，20 μL 样品，电压80 V 浓缩胶，120 V 分离胶，100 V 恒压转膜40 min，5%胎牛血清封闭1 h，抗体Actin（1∶2 000），活性半胱氨酸蛋白酶3（cleaved cas‐pase 3，1∶1 000），活性半胱氨酸蛋白酶8（cleaved cas‐pase 8，1∶1 000），增殖细胞核抗原（Ki‐67，1∶1 000）4 ℃孵育过夜。第2 天，二抗孵育后化学发光液（ECL）显影。

2 结果

2.1 3 组细胞增殖能力比较 与对照组相比，医用外科口罩条件培养基组BEAS‐2B 细胞增殖受到抑制（P＜0.05），但是一次性口罩条件培养基组BEAS‐2B 细胞增殖与对照组相比，受到的抑制更为明显（P＜0.01），且与医用口罩条件培养基组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot 检测Ki‐67 结果进一步证实了这一结果。见图1、图2。

图1 MTT 检测BEAS‐2B 在不同条件培养基中增殖能力

图2 Western blot 检测细胞增殖标志物Ki67 的表达

2.2 3 组细胞活性比较 与对照组相比，医用外科口罩条件培养基组BEAS‐2B 细胞活性受到抑制（P＜0.05），但是一次性口罩条件培养基组BEAS‐2B 细胞增殖与对照组相比受到抑制更为明显（P＜0.01），而且与医用口罩条件培养基组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 克隆形成实验检测不同条件培养基对细胞活性的影响

2.3 3 组细胞凋亡情况比较 与对照组相比，医用外科口罩条件培养基组BEAS‐2B 细胞凋亡标志蛋白活性cleaved caspase 3 和8 表达升高（P＜0.05），但是一次性口罩条件培养基组这两个蛋白升高更为明显（P＜0.01），而且与医用外科口罩条件培养基组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 Western blot 检测不同条件培养基对细胞凋亡的影响（Actin 为内参）

3 讨论

呼吸系统相关的卫生事件多发，常见的流行性感冒、风疹、流行性腮腺炎、水痘[11‐13]，以及更为危险的重症急性呼吸综合征（SARS）[14]、新型冠状病毒肺炎等，这些传染病主要通过呼吸道传播，因此呼吸道的防护成为对抗这些疾病的基本且有效的措施。本研究结果显示，两种口罩滤过后的香烟烟雾融入到培养基中，都能够抑制正常肺上皮细胞的增殖和活性，并且诱导细胞凋亡。但是医用外科口罩对细胞的影响较小，也就是说，虽然两种口罩都不能做到完全有效防护，但是医用外科口罩的防护能力明显高于一次性口罩。

在正常工作中，医护人员感染呼吸道病毒的病例不在少数[15]。尽管医护人员要求在进行高感染风险医疗活动或准备进入隔离病房时需配戴口罩，平时工作中是否需要佩戴口罩并没有明确的要求[16]。但是没有症状的病毒携带者也是重要的传染源，因此医护人员在工作过程中全程佩戴口罩是很有必要的，而且要尽量选择医用外科口罩，以保证有更好的防护效果。