硫化氢对局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织神经元凋亡的影响

李国风 张勤增 解丽君 姜红 李立萍 郝娜 张建新

中风是导致残疾的重要原因之一，其损伤的相关危险因素主要包括：兴奋性损害、Ca2+超载、自由基及脂质过氧化、线粒体功能障碍、细胞凋亡、炎性细胞因子失衡等。目前，溶栓仍为临床治疗脑缺血的主要手段，但一部分患者在溶栓治疗后由于再灌注等原因导致病情加重。因此，有关脑缺血损伤的发病机制、预防措施及治疗手段成为当今医学研究的热点之一。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是机体内一种重要的气体信号分子，研究表明，H2S在多种病理生理过程尤其是脑缺血过程中发挥着重要作用[1]。凋亡又称程序性细胞死亡，是一种由基因调控的主动而有序的细胞死亡过程。凋亡是参与缺血性脑损伤过程中细胞死亡的一种重要形式[2]。最近研究表明，H2S与凋亡密切相关，但其在凋亡过程中的确切机制尚不明确[3,4]，尤其是在脑缺血后引起的细胞凋亡过程中的作用尚不清楚。本实验采用免疫组织化学、Western blot、TUNEL等方法，观察H2S对局灶性脑缺血损伤后神经元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，从凋亡途径探讨在H2S对大鼠局灶性脑缺血损伤作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体重(265±15)g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：201108043。

1.1.2 试剂：兔抗Caspae-3单抗武汉博士德公司；鼠抗bcl-2单抗美国Santa Cruz；鼠抗bax单抗美国Santa Cruz；分子量标准蛋白质中国上海生物工程公司；SP免疫组化检测试剂盒北京中山公司；N,N,N,N,-四甲基乙二胺(TEMED)，美国Sigma；其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器：电泳仪DYY-Ⅲ7B型水浴电转膜仪DYY-Ⅲ40B北京市六一仪器厂；低温高速台式离心机Hitachi 20PI-52型日立公司；电子分析天平梅特勒-AE240瑞士梅特勒公司；超低温冰箱(-80℃) 日本SANYO公司；

1.2 大鼠局灶性脑缺血模型制备 将40只大鼠随机分为5组，分别为假手术组、缺血模型组、H2S低剂量组、H2S中剂量组、H2S高剂量组，每组8只。大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用电热烧灼器将颈外动脉的分支烧断，结扎并游离颈外动脉主干一段，在颈外动脉游离段上剪开一小口，将预先制备好的尼龙线栓子插入，尼龙线插入深度平均为(18.5±0.5)mm。以插入尼龙线栓子作为缺血记时的开始，动物苏醒后，出现霍纳(Horner)综合征：左侧眼裂变小并右侧偏瘫，以右上肢更为明显；提尾悬拉后出现右上肢蜷缩屈曲；下地不能直行，向右侧转圈跌倒，挑选手术成功、符合上述标准的大鼠进行实验。假手术组颈部切开，只分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉但不剪开血管和插入插线栓。H2S低、中、高剂量组分别于大鼠脑缺血3 h时腹腔注射0.7、1.4、2.8 mg/kg的H2S，假手术组和缺血模型组注射等容量的0.9%氯化钠溶液。5组大鼠均于缺血24 h腹主动脉取血并断头取脑。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 HE染色观察组织学变化：5组大鼠均于缺血24 h断头取脑，以视交叉附近冠状切片，切片厚度约为4 mm，以10%甲醛溶液固定切片，70%～100%的乙醇浓度梯度脱水，然后于二甲苯中透明2次，再入石蜡中进行包埋，仔细修好蜡块后固定于石蜡切片机上进行切片，片厚为4 μm，将蜡片完全展开并贴附在清洁干燥的载玻片上，4℃冰箱保存，进行常规HE染色，光镜观察染色结果。

1.3.2 TUNEL法检测神经细胞凋亡率：切片常规脱蜡至水，用蛋白酶K(20 μg/ml溶于Tris/HCL中，pH值7.4～8.0)室温孵育15～30 min。PBS冲洗2次，滴加50 μl的TUNEL反应混合溶液，湿盒中孵育60 min，PBS冲洗3次，加入50 μl转化剂，在湿盒中37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，加入100 μl DAB底物溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3次。封片，在光镜下分析结果。细胞内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫者为阳性细胞。

1.3.3 免疫组织化学法(生物素-抗生物素-过氧化物酶复合物ABC法，简称ABC法)检测Bcl-2和Bax的表达：10%甲醛溶液固定脑组织标本，石蜡切片并脱蜡至水，缓冲液清洗3次，5 min/次，3%的H2O2-甲醇常温孵育20 min，缓冲液清洗3次，5 min/次；水浴锅中95℃加热修复抗原20 min后血清封闭，室温孵育30 min；加入稀释一抗后4℃过夜；次日缓冲液清洗3次后加入与一抗特异结合的生物素标记二抗，37℃湿盒孵育30 min，再加入与二抗结合的三抗，37℃湿盒孵育30 min；缓冲液清洗3次，DAB显色20 min，显微镜下观察并控制显色程度；蒸馏水充分冲洗数遍终止进行的颜色反应；苏木素行复染并乙醇梯度脱水，二甲苯透明，采用树脂封片，普通光学显微镜观察阳性细胞表达部位并记数：在400倍光镜视野下对切片随机取8个视野进行计数。

1.3.4 Western Blot检测Caspase-3蛋白的表达：取大鼠脑组织约60 mg加入1 ml细胞裂解液充分研磨，12 000 g/min离心10 min，将上清液蛋白提取液和点样缓冲液1∶1体积混匀，置沸水中变性约8 min，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃约4 h(浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V)，将PVDF膜和滤纸置转移缓冲液中浸泡约20 min，切去凝胶的左上角作为正反面的标记，缓冲液中约10 min平衡凝胶，转移盘由下至上按顺序放置海绵、滤纸、凝胶、转移膜、滤纸、海绵，赶尽气泡，锁紧转移盘，胶侧是负极，膜侧是正极，温度4℃，电压100 V，转移2 h，丽春红染色检查蛋白转移程度，漂洗膜(T-TBS缓冲液)5%的脱脂奶粉室温震荡封闭约2 h，加入稀释一抗，充分颠倒混匀后4℃封闭过夜后加入二抗，37℃震荡1 h，暗室爆光，相机拍照，AlphEase FC软件分析结果，目的蛋白条带灰度值与其目的蛋白GAPDH灰度值比值对比进行结果分析。

2 结果

2.1 HE染色观察H2S对局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织形态学变化的影响 光镜结果显示，假手术组大鼠缺血侧脑组织神经细胞核仁清晰、核圆形，核膜完整；而缺血模型组大鼠缺血侧脑组织出现严重的神经细胞坏死，细胞肿胀，胞核浓缩，胞浆疏松淡染及空泡化；H2S 中、高剂量组上述病理变化明显改善。见图1。

假手术组缺血模型组H2S高剂量组H2S中剂量组H2S低剂量组

图1 5组大鼠脑组织形态学改变图(光学显微镜×400)

2.2 TUNEL 法检测H2S对局灶性脑缺血损伤大鼠脑神经元凋亡的影响 TUNEL检测结果显示，缺血组大鼠神经细胞核呈棕黄色，着色细胞数多且着色深，凋亡率明显高于假手术组 (P<0.01)，H2S中、高剂量组脑神经元的凋亡百分率明显降低，并且着色细胞数减少，着色变浅(P<0.01)。见图2，表1。

假手术组缺血模型组H2S高剂量组H2S中剂量组H2S低剂量组

图2 5组大鼠神经元Tunnel检测结果图

2.3 H2S对局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 免疫组化检测结果显示，Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞在光镜下染色呈现棕黄色，主要在神经元胞浆和血管内皮表达。假手术组可见少量的Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞，缺血模型组可见少量Bcl-2和大量Bax阳性细胞；与缺血模型组比较，H2S 中、高剂量组Bcl-2阳性细胞数明显增加，Bax 阳性细胞数明显减少(P<0.01)。见图3、4，表1。

假手术组缺血模型组H2S高剂量组H2S中剂量组H2S低剂量组

图3 5组大鼠脑组织Bcl-2表达免疫组化图(SP×400)

2.4 H2S对局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，与假手

假手术组缺血模型组H2S高剂量组H2S中剂量组H2S低剂量组

图4 5组大鼠脑组织Bax表达免疫组化图(SP×400)

术组比较，缺血模型组大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.01)，与缺血模型组比较，H2S 中、高剂量组Caspase-3蛋白表达明显减少(P<0.01)。见图5，表1。

假手术组缺血模型组H2S高剂量组H2S中剂量组H2S低剂量组

图5 5组大鼠脑组织caspase-3表达 western blot 图

组别剂量(mg/kg)凋亡率(%)Bcl-2(%)Bax(%)Caspase-3(相对密度)空白对照组-9.68±2.2316.39±4.107.22±1.071.26±0.17缺血模型组-20.71±2.88*11.81±3.04*31.45±3.77*4.43±0.42*H2S高剂量组2.811.28±3.21#27.25±3.04#22.01±2.89#3.77±0.47#H2S中剂量组1.413.19±1.97#23.72±2.73#25.82±3.67#3.51±0.64#H2S低剂量组0.719.98±2.5512.72±2.2430.82±4.624.35±0.89

注：与空白对照组比较,*P<0.01;与缺血模型组比较,#P<0.01

3 讨论

脑缺血是非常严重的临床疾病之一，尤其是缺血导致的神经元坏死，具有极高的致死率，即使是幸存患者，其生活质量也严重下降，同时引起诸多家庭和社会问题。脑缺血后的氧化应激反应引起神经元损伤，进而导致神经元坏死；缺血可激活凋亡蛋白，启动凋亡程序进而引发神经元凋亡；缺血同时可激活大量炎性细胞因子，引起局部严重的炎性反应；总之关于脑缺血的机制和治疗成为当今社会的研究热点之一。

H2S已经被确定为继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子，具有气体信号分子的一系列特征[5]。目前的研究表明，内源性H2S的生成途径有三条，胱硫醚β合酶途径、胱硫醚γ裂解酶途径、3-巯基丙酮酸转硫酶途径[6]。H 2S在体内可水解为Na+和 HS-，HS-可与体内的H+再结合后生成H2S，H2S和NaHS之间以水解和结合的形式形成一种动态平衡 。H2S可自由通过细胞膜，存在于机体的多个组织器官，生理状态下即发挥着重要作用：舒张血管和消化道平滑肌、抑制血管平滑肌细胞增殖、参与神经元兴奋、调节学习和记忆功能等。

许多研究已经表明H2S是一种新型的神经调节因子和信号传递份子，参与多种中枢神经系统疾病的病理生理过程，如阿尔莫茨病、同型半胱氨酸尿症、低下综合征、反复热性惊厥、缺血再灌注损伤等[7]。本实验室前期研究结果表明， H2S可通过降低脑组织的氧化应激反应改善缺血性脑损伤，通过线粒体途径的细胞凋亡途径参与脑缺血的病理生理过程，并且不同剂量的外源性H2S对脑缺血可产生双重作用[8,9]。硫化氢还能抑制局灶性脑缺血后NF-κB的活化，阻断NF-κB相关信号通路的传导，下调TNF-α、IL-1β的表达，上调IL-10的表达，从而减轻脑缺血损伤[10,11]。本研究结果表明，外源性给予H2S的供体NaHS，局灶性脑缺血大鼠的缺血神经组织损伤明显减轻，同时神经细胞凋亡率明显减低、Bax和Caspase-3蛋白表达明显减少，Bcl-2蛋白表达增加，表明外源性给予H2S，在改善脑组织氧化应激、炎性反应的同时，还可通过抑制神经细胞凋亡而改善脑缺血损伤。

细胞凋亡是受基因调控的程序化细胞主动自毁过程，研究表明，其过程主要涉及两种信号通路：一条是通过Fas/FasL及TNF/TNFR依次激活Caspase-8和Caspase-3的死亡受体通路；一条是线粒体途径的信号通路，即线粒体在各种凋亡刺激信号的细胞整合过程中起核心作用。线粒体外膜富含多不饱和脂肪酸，凋亡刺激信号经逐级放大后进而攻击线粒体外膜导致线粒体肿胀，线粒体膜流动性的降低导致线粒体膜通透性转换孔迅速开放，进而激发细胞色素C及相关凋亡诱导因子的释放，启动Caspase蛋白酶的级联反应： Caspase-9首先活化，而后下游Caspase-3进一步活化，最后细胞凋亡发生[11,12]。不管以上哪种途径，激活凋亡的最后通路都是活化Caspase-3。Caspase-3 是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，正常状态下在细胞内以无活性的前体形式存在，脑缺血后活化并参与调控神经元的凋亡过程，是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，是凋亡的效应分子和执行者。它的活化可激活核酸内切酶、降解DNA修复酶和细胞骨架蛋白进而导致细胞凋亡[13]。脑缺血损伤后，缺血的核心区和半暗带区神经元死亡的机制并不相同，一般认为坏死主要发生在缺血的核心区，而凋亡主要发生在缺血核心区的周边区域，即半暗带区域[14，15]。由于发生凋亡的细胞不会立即死亡，因此为药物干预治疗提供了可能。本实验结果显示，脑缺血后出现了严重的神经细胞损伤，脑组织Caspase-3蛋白表达明显上升，细胞凋亡率显著升高， 而给予H2S后大鼠Caspase-3蛋白表达减少，神经细胞凋亡率降低，表明Caspase-3参与了局灶性脑缺血损伤后神经元凋亡的发生，外源性给予H2S可能通过抑制Caspase-3激活或释放而发挥抗凋亡作用。

Bcl-2和Bax为同源二聚体，是Bcl-2家族中非常重要的基因，两者作用相互拮抗，Bcl-2起到抑制细胞凋亡作用，而Bax则起到促进细胞凋亡作用[16-18]。Bcl-2大量生时保护细胞免受攻击，当Bax过量生成时则形成Bax同源二聚体从而促进细胞凋亡。Bcl-2通过与Bax组成异源二聚体，从而阻止Bax诱导的凋亡作用。因此，Bcl-2与Bax蛋白的比例在一定程度上决定了细胞是凋亡还是存活[19，20]。本研究结果显示，缺血后神经细胞凋亡率明显升高，Bax蛋白表达增强， Bcl-2蛋白表达减弱； 给予H2S后，Bcl-2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减弱，表明H2S可通过调整Bcl-2/Bax平衡而发挥减轻缺血性脑损伤作用。本研究结果为H2S应用于临床治疗脑缺血损伤提供了理论基础。