水稻根际促生菌筛选及其对水稻促生效果研究

金月波

（辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009）

我国是世界上人口最多的国家之一，而半数以上人口的主食是稻米，可见我国对稻米市场需求量十分巨大。确保水稻生产稳定的重要措施之一就是合理的施肥种植技术[1]。化肥在一定的程度和时间上对我国农业增产增收起了巨大的作用，但化肥与农药的过度使用和依赖，造成了土壤环境难以修复的破坏[2-3]，肥料利用率低下、农业成本高[4-7]。同时施肥过量还常会产生粮食安全问题[8-9]。阻碍了农业可持续发展。微生物是解决农业可持续发展问题的突破口，微生物肥料将成为引领未来肥料产业发展的新方向，支撑中国农业可持续发展的必然选择[10]。本研究是从水稻田分离筛选优良的自生固氮菌、溶磷细菌和解钾细菌，旨在提高水稻产量，改善水稻品质，降低化学肥料使用量，保护农业生态环境。

1 试验材料

1.1 土壤样品的采集

分离细菌的土样采自辽宁省盘锦市郊区养蟹水稻田。采用10点取样，除去表土，将附有根际土壤的水稻根装入无菌袋中，并编号、记录采集地点、日期。带回实验室密封保存3个月后进行促生菌的分离。

1.2 水稻种子

丰优301（购于沈阳市沈北新区种子公司）。

1.3 培养基

所用化学试剂均为国产分析纯制品。

1.3.1 阿须贝培养基

Ashby无氮培养基：甘露醇10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O，0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO35g，pH7.2，蒸馏水1 000mL。121℃灭菌20min。

1.3.2 硅酸盐细菌筛选培养基

钾长石粉（200目）2.0g，甘露醇10.0g，NaH2PO40.5g，MgSO40.2g，NaCl 0.2g，CaSO40.2g，CaCO31.0g，pH7.4～7.6，蒸馏水1 000mL。121℃灭菌20min。

1.3.3 磷细菌筛选培养基

蔗糖10.0g，Ca3（PO4）25.0g，NaCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，（NH4）2SO40.5g，KCl 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，pH7.0～7.4，蒸馏水1 000mL。121℃灭菌20min。

2 试验方法

2.1 水稻根际细菌的分离与纯化

取附有土壤的水稻根须，剪断放入装有225 mL无菌水的三角瓶中，制成菌悬液，采用10倍梯度稀释法稀释成系列菌悬液。

2.1.1 自生固氮菌的分离与纯化

将不同稀释度的菌悬液分别涂到阿须贝无氮培养基平板上，3次重复。28℃培养48h，挑取平板上生长旺盛的菌落。采用交叉划线法分离纯化3～4次，传代5次。保藏。

2.1.2 硅酸盐细菌的分离与纯化

将不同稀释度的菌悬液分别涂到硅酸盐细菌培养基平板上，3次重复。28℃培养48h，挑取平板上生长旺盛的光滑透明油滴状菌落。采用交叉划线法分离纯化3～4次，传代5次。保藏。

2.1.3 溶磷细菌的分离与纯化

将不同稀释度的菌悬液分别涂到磷细菌筛选培养基平板上，3次重复。28℃培养48h，挑取溶磷圈大的菌落。采用交叉划线法分离纯化3～4次，传代5次保藏。

2.2 水稻根际细菌的复筛

2.2.1 自生固氮菌的筛选

将筛选得到的自生固氮菌菌株摇瓶培养，凯氏定氮法测其固氮酶活性[11]，选取固氮酶活性高的菌株。

2.2.2 硅酸盐细菌的筛选

将筛选得到的硅酸盐细菌菌株摇瓶培养，原子吸收法[12]测其发酵液中可溶性钾的含量，选取解钾活性高的菌株。

2.2.3 溶磷细菌的筛选

将筛选得到的溶磷细菌菌株摇瓶培养， 钼锑抗比色法[13]测其溶磷活性大小，选取溶磷活性高的菌株。

2.3 水稻根际细菌的平皿栽培试验

每个直径9 cm的平皿加入20g灭菌的河沙，分别加入阿须贝无氮液体培养基、硅酸盐细菌液体培养基以及磷细菌筛选液体培养基15 ml，混匀。分别接种对水稻生长有较好促生效果的固氮、解钾、溶磷菌株，不接菌作空白对照。每皿10粒水稻种子，3次重复，置于28℃光照培养室内培养，每天喷水3～4次，观察水稻长势，播种15 d后收获，将苗贴培养基处剪下，测定株高、鲜重和干重。

2.4 筛选所得菌株的初步鉴定

2.4.1 菌株的形态及染色试验

将自生固氮菌、硅酸盐细菌、溶磷细菌分别接种在阿须贝无氮培养基、硅酸盐细菌培养基、磷细菌筛选培养基上，培养16～24h，进行革兰氏染色；在光学显微镜下观察个体形态。培养36h进行芽孢、荚膜和鞭毛染色[14]。

2.4.2 菌株的生理生化特性

对菌株进行唯一碳源试验、唯一氮源试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验（M.R.）、V.P.试验、淀粉水解试验、纤维素分解试验、吲哚试验、明胶液化试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、氧化酶试验、H2S试验、糖醇发酵试验及细菌运动性观察[15～16]。

3 结果与分析

3.1 水稻根际细菌的筛选结果

用稀释平板涂布法对水稻植株根际土壤样品进行细菌分离，共得到13株在阿须贝无氮培养基上旺盛生长的细菌，15株在硅酸盐细菌培养基上生长良好的细菌，8株在磷细菌筛选培养基上生长良好的细菌。经多次传代培养后，部分菌株活性减弱或丧失，最终获得自生固氮菌2株，编号为N02、N11；硅酸盐细菌3株，编号为K01、K06、K09；溶磷菌1株，编号为P07。各菌株分别接入相应无氮、解钾、溶磷液体培养基中培养，测得各菌株固氮、解钾、溶磷效果见图1、2、3。由图1可见，N02和N11均有固氮能力，N11的固氮效果最好，固氮量为2.37μg/m l，对照组无固氮能力。由图2可见，硅酸盐细菌K01解钾能力最强，菌液含钾量高达55.9μg/ml。由图3可见，溶磷菌P07菌液含磷量为69.0μg/m l，比对照高158.4%。选择N11、K01、P07菌株进行下一步水稻平板栽培试验。

3.2 水稻根际细菌的平皿栽培试验结果

由表1可见，接种了N11的水稻株高比对照增加了29.08%，鲜重增加了30.84%，干重增加了19.45%。说明N11菌株对水稻苗期生长有促进作用。

图1 固氮菌的固氮情况

图2 硅酸盐细菌的解钾情况

图3 溶磷菌的溶磷情况

表1 接种固氮菌的水稻平皿试验结果

由表2可见，接种了K01菌株的水稻株高增加了13.32%，鲜重增加了10.04%，干重增加了11.42%。说明K01菌株对水稻苗期生长有促进作用。

表2 接种硅酸盐细菌的水稻平皿试验结果

由表3可见，接种了P07的水稻株高比对照增加了14.20%，鲜重增加了8.19%，干重增加了14.46%。说明P07菌株对水稻苗期生长有促进作用。

表3 接种溶磷细菌的水稻平皿试验结果

3.3 菌株初步鉴定结果

将自生固氮菌N11、硅酸盐细菌K01、溶磷菌P07进行形态和生理生化鉴定，各菌株的菌体形态特征、菌落特征及革兰氏染色结果见表4。

表4 菌株的菌体形态特征、菌落特征及革兰氏染色

菌株N11接触酶实验、淀粉水解实验、VP实验、细菌运动性实验、产H2S实验阳性，能利用淀粉、甘露醇、苹果酸，初步确定属于固氮菌属菌株。菌株K01接触酶实验、柠檬酸盐实验、硝酸盐还原实验、过氧化氢实验、VP实验、细菌运动性实验及葡萄糖发酵实验阳性，初步确定属于芽孢杆菌属。菌株P07硝酸盐还原实验、氧化酶实验、接触酶实验、甲基红实验、产H2S实验、细菌运动性实验阳性，能利用葡萄糖，初步确定属于假单孢菌属。

4 结论与讨论

4.1 结论

试验从水稻根际土壤中分离得到自生固氮菌13株，硅酸盐细菌15株，溶磷菌8株，经多次传代、液体培养复筛，确定固氮、解钾、溶磷能力最强的菌株N11、K01、P07进行水稻平皿栽培试验，根据对水稻株高、鲜重和干重的结果比较，各菌株对水稻苗期生长均有促进作用。菌株初步种属鉴定结果：菌株N11、K01、P07分别属于固氮菌属、芽孢菌属和假单孢菌属。

4.2 讨论

据统计，2015年辽宁省稻田养殖面积达81 533.3 hm2，盘锦稻田养蟹面积达52 533.3 hm2，已成为我国北方最大的河蟹养殖基地，营口、锦州、丹东等地区也有一定规模的稻田养殖[17]。本研究所用土壤样品采自盘锦养蟹稻田，目的是分离、筛选出适应养蟹稻田生态环境、对养蟹稻田水稻具有明显促生作用的自生固氮菌、溶磷细菌和解钾细菌。所采土壤样品密封保存3个月后进行促生菌的分离筛选，目的是通过自然筛选排除不易长期保存的劣质性状菌株，以减少不必要的工作负担。

在平皿上表现出对水稻苗期生长有促进作用的各菌株，能否在环境更为复杂的水稻土壤中迅速生长繁殖、能否相互协同促进水稻生长发育、彼此能否产生拮抗作用，还有待于进一步研究。