松树土壤根际微生物溶磷基因的克隆与表达

吴雪　金辉　唐健

摘要：探究土壤根際微生物溶磷基因对难溶性矿物质磷的溶解作用。利用从土壤中提取宏基因组，克隆了GabY基因，并构建了表达载体，研究了该基因在大肠杆菌DH5α的表达对难溶矿物质磷酸Ca3（PO4）2的溶解作用。结果表明，构建的GabY表达载体成功表达；对照组产酸能力较试验组弱，且对照组溶磷效率要低于试验组，直接从植物根际土壤微生物宏基因组中筛选溶磷基因对矿物质无机磷的溶解的研究可行。

关键词：根际微生物；溶磷；GabY基因

中图分类号：S714.3；S791；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）20-3952-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.039

Abstract： To study the dissolving function of GabY gene on mineral inorganic phosphorus. The macro genomic DNA from soil was extracted，GabY gene was cloned， and then integrated into expression vector pETDuet-1，induced the integrated vector expression in DH5α to research the dissolving function on Ca3（PO4）2. The results showed GabY gene expression was successfully induced，and was able to promote the dissolving efficiency of inorganic phosphorus. Directly selected the mineral inorganic phosphorus soluble gene from soil macro genomic DNA is a viable method.

Key words： rhizosphere microorganisms；soluble phosphorus；GabY gene

磷是植物生长所必需的一种矿物质元素，而土壤中能被植物直接吸收利用的磷的含量是很低的，绝大多数的磷是以难溶解的无机磷形式存在[1，2]，而磷肥的大量使用易对环境造成严重的污染。关于微生物对植物利用自然界中无机磷进行了大量研究，如Badu-Khan等[3]、Shahid等[4]、Anzuay等[5]在矿物质磷溶解基因（Mps+）方面都做过大量研究，其中包括GabY和PQQA、PQQB、PQQE等PQQ家族基因；国内也对此做了相关研究[6]。广西壮族自治区典型的桉树林喀斯特地貌以及马尾松红色土质蕴含着大量的矿物质无机磷，因此对广西桉树林土壤中溶磷微生物的研究有着很重要的意义。本研究以广西桉树林和马尾松根际土壤中宏基因组入手，研究宏基因组中的溶磷基因的溶磷效率，为马尾松林和桉树林土质改造提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 土壤来源

南宁本地马尾松林根际土壤和桉树林根际土壤混合体。

1.2 培养基及试剂

PKO培养基[7]：Glucose，10 g；Ca3（PO4）2，5 g；（NH4）2SO4，0.5 g；NaCl，0.2 g；MgSO4·7H2O，0.1 g；KCl， 0.2 g；Yeast extract，0.5 g；MnSO4·H2O，0.002 g；FeSO4·7H2O，0.002 g。

LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%NaCl（含100 μg/mL的Amp，过滤除菌）。

抗坏血酸（100 μg/mL）：10 g抗坏血酸加去离子水定容至100 mL，4 ℃保存；钼酸盐溶液：13 g钼酸铵定容至100 mL加入300 mL硫酸（1∶1）混匀后加入100 mL酒石酸锑钾溶液（0.35 g定容至100 mL），置于棕色瓶4 ℃保存。

1.3 质粒与菌种

pETDuet1载体、DH5α感受态细胞均为广西壮族自治区林业科学研究院实验室保存。

1.4 土壤宏基因组提取

基因组DNA提取参考文献[8]。

1.5 目的基因扩增

根据所设计的引物对扩增目的基因GabY：SP：GAATTGATCTGGCTGAACATGGCGACC（斜体为EcoR Ⅰ酶切位点）；AP：AAGCTTCATAGGTCAGCTT GTGGACGCCG（斜体为Hind Ⅲ酶切位点）；PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6 载体构建及表达

用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切目的基因与pETDuet1载体，并将目的基因酶切片段与pETDuet1载体采用DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒连接，具体方法参照说明书。大肠杆菌感受态转化连接产物，400 mL SOC恢复培养1 h后涂布含100 μg/mL Amp的LB平板，挑选阳性克隆扩大培养，并用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切验证。

1.7 溶磷试验

磷标准曲线绘制参考文献[9]。将阳性克隆用接种环接种到IPTG终浓度为100 mmol/L的PDA固体无机磷培养基中，28 ℃培养3～5 d，观察溶磷圈的情况。将1 mL菌液加到含有50 μg/mL Amp的PDA液体培养基中，37 ℃培养至OD600 nm约为0.6时，加入1 mmol/L的IPTG，于28 ℃进行诱导表达。分别于2、4、8、24、48 h取样，检测培养基溶解磷含量；同时，在相同条件下将菌种接到LB培养基中，并测定pH。endprint

2 结果与分析

2.1 土壤宏基因组的提取

将桉树根际土壤和马尾松根际土壤混合，参考文献[8]提取了土壤宏基因组，琼脂糖凝胶电泳显示其大小约为23 kb（图1）。

2.2 表达载体的构建

Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ分别双酶切GabY基因片段和质粒pETDuet1，4 ℃连接过夜，筛选的克隆提取质粒后再经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切验证。结果（图2）表明，单酶切条带约为5 900 bp；双酶切条带分别为5 400、460 bp，与预测结果相符。

2.3 溶磷试验

2.3.1 PKO固体培养基上溶磷圈结果 通过定性试验，结果（图3）表明，试验组（B）的溶磷情况较对照组（A）明显，由此显示GabY基因表达，能够获得良好的溶磷效果。

2.3.2 PKO液体培养基中无机磷含量变化 在加入诱导剂IPTG前，培养基中存在微量溶磷，但随着诱导时间的延长，表达GabY基因的菌种溶磷情况明显较对照组好，在24 h时溶解磷含量分别为（41.0±1.41）、（5.1±0.14） μg/mL（圖4）。

2.3.3 LB液体培养基pH变化 LB培养基初始pH为7.2，随着诱导时间的延长，试验组与对照组的pH均有下降趋势，但试验组趋势要比对照组明显，到48 h时对照组的pH为6.15，而试验组则下降至4.6，表明试验组产酸能力明显好于对照组，反映出试验组的溶磷效率较比对照组高（图5）。

3 小结与讨论

针对广西卡斯特地质及红土为主，其中土壤岩层无机矿物质磷含量十分丰富，且经济植被以松树林及桉树为主，土壤中磷含量对于农作物、经济植被等的生长十分重要，但土壤中的磷多以无机矿物质磷形式存在，不利于植物的吸收利用。国内外学者早已开展对于土壤溶磷微生物的研究[10，11]，如邢芳芳等[12]在玉米根际土壤中筛选出的高效溶磷菌在以Ca3（PO4）2为惟一磷源的无机磷液体培养基中培养6 d水溶磷含量可达429.2 mg/L，是对照组的45.95倍。本研究从广西松树林土壤样品中直接提取土壤微生物宏基因组，通过克隆已报道的溶磷基因，构建表达载体从而免去了繁杂的菌种筛选工作。在溶磷机制研究方面，国外研究显示大肠杆菌DH5α因无法合成PQQ（吡咯喹啉醌）而无解磷作用，而当转化有PQQ合成基因或其他如GabY等基因的表达载体时，就能产生GA（葡萄糖酸），GA与磷酸盐作用，从而释放出无机磷[13]。因此，根据溶磷微生物产酸来增加矿物质无机磷溶解的特性，对于土质改良等方面有着十分重要的意义。

参考文献：

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[5] ANZUAY M S，FROLA O，ANGELINI J G，et al. Effect of pesticides application on peanut（Arachis hypogaea L.） associated phosphate solubilizing soil bacteria[J].Applied Soil Ecology，2015，95：31-37.

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