调控线粒体膜电位青蒿琥酯诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡作用

陈乐彤 刘江惠 刘亮 王静 徐志彬

(河北医科大学第四医院 1肿瘤研究所，河北 石家庄 050011；2内镜科)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，居消化道恶性肿瘤发病率第一位，且病死率高〔1，2〕，目前，手术、化疗及放疗仍是胃癌的常规治疗方法。手术是胃癌的首选治疗方法，但在目前，较多的胃癌患者初诊时已是中晚期，无法进行手术治疗，对于这些患者，化疗就成为其最主要的治疗方法之一，但是由于化疗药物的高毒副作用及多药耐药性，往往影响化疗的疗效，甚至导致化疗失败。因此，寻找高效、低毒的抗胃癌药，可有效地提高胃癌患者治疗效果，延长患者生存期。在中国利用中草药进行肿瘤治疗已具有悠久历史，且其具有低毒、高效、价廉等优点。青蒿琥酯(Art)是青蒿素的一种衍生物，主要来源于植物黄花蒿。Art是高效低毒的抗疟疾药物，且在耐药及重型疟疾治疗上具有较大的优势，治疗效果较佳〔3～5〕，随着对Art的进一步深入研究，发现，Art除了具有抗疟疾作用以外，其还具有抑制肿瘤细胞生长等作用〔6～9〕。已有大量文献报道，Art对多种肿瘤细胞具有生长抑制及诱导细胞凋亡作用〔10，11〕，但在胃癌细胞中的研究较少，且具体机制尚未阐明。本文主要利用细胞实验，通过Art干预胃癌SGC-7901细胞生长，研究Art是否具有抑制胃癌细胞生长作用，并进一步探讨其抑制胃癌细胞生长作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒，美国Beckman Coulter公司；Art，中国桂林南药股份有限公司；小鼠抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及B细胞淋巴瘤2相关蛋白(Bax)抗体，美国Santa Cruz公司；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体，中国北京中杉金桥公司；若丹明(Rho)123，中国北京索莱宝科技有限公司；人胃癌细胞株SGC-7901，中国中科院上海细胞库。FC500型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1Art干预SGC-7901细胞实验分组 收集处于对数生长期的胃癌SGC-7901细胞，调整细胞浓度为5×106/ml，将1 ml细胞悬液接种至细胞培养瓶，带细胞贴壁后，且细胞融合度达到80%左右，细胞处于对数生长期，加入不同浓度Art，使药物终浓度分别达到30、60、120 μmol/L，生理盐水代替Art作为对照组。Art干预细胞24 h，收集细胞，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，调整细胞浓度为1×106/ml。每组实验重复3次。

1.2.2Art干预SGC-7901细胞后细胞凋亡检测 取上述制备的单细胞悬液1 ml，含1×106细胞。利用冷PBS洗细胞1次，去除上清液，冷1×结合缓冲液100 μl 悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 试剂10 μl，4℃避光放置15 min，而后加入1×结合缓冲液380 μl，随后加入碘化丙啶(PI)染液10 μl 4℃避光放置15 min，冷PBS洗涤细胞1次，1ml PBS悬浮细胞后，利用流式细胞仪进行检测。

1.2.3Art干预SGC-7901细胞后细胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白检测 取上述制备的单细胞悬液1 ml，含1×106细胞，冷PBS洗涤细胞1次，PBS 100 μl悬浮细胞，放入流式细胞仪上样管中，设置3个平行管。分别向其中加入小鼠抗人Bcl-2、Bax及兔抗人Caspase-3抗体100 μl，室温放置30 min，而后PBS洗涤细胞1次(1 000 r/min，5 min)，去除上清液后，100 μl PBS液悬浮细胞，分别向每管中加入羊抗小鼠及羊抗兔IgG-FITC荧光二抗，室温避光放置30 min，PBS洗涤细胞1次(1 000 r/min，5 min)，去除上清液后，1 ml PBS液悬浮细胞，300目尼龙网过滤后，流式细胞仪检测细胞。同时设置只加IgG-FITC二抗不加一抗的同型对照组。以平均荧光强度表示蛋白表达量。

1.2.4Art干预SGC-7901细胞后细胞线粒体膜电位检测 取上述制备的单细胞悬液1 ml，含1×106细胞，冷PBS洗涤细胞1次，PBS 100 μl悬浮细胞，放入流式细胞仪上样管中，向上样管加入Rho 123染料，使终浓度达到10 μg/ml，37℃ 下避光放置30 min，PBS洗涤细胞1次后，1 ml PBS悬浮细胞，300目尼龙网过滤后，流式细胞仪检测细胞。流式细胞术检测细胞线粒体膜电位水平以平均荧光强度表示。

1.3统计学分析 采用SPSS11.5软件进行方差分析，LSD-t检验。

2 结 果

2.1Art诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡 30、60、120 μmol/L Art干预胃癌SGC-7901细胞24 h，细胞凋亡率分别为〔(5.48±0.67)%、(12.55±1.17)%、(23.43±2.18)%〕显著高于对照组〔(0.87±0.14)%,P<0.05〕；120 μmol/L Art组细胞凋亡率显著高于30及60 μmol/L Art组(P<0.05)，见图1。

图1 青蒿琥酯作用SGC-7901细胞24 h后细胞凋亡

2.2Art下调SGC-7901细胞中Bcl-2蛋白表达、上调细胞中Bax蛋白表达 30、60、120 μmol/L Art组SGC-7901细胞中Bcl-2及Bax蛋白表达水平分别为(435.79±7.10、397.76±10.28、362.76±8.74) 及(316.77±5.93、352.40±5.96、388.56±9.30)；对照组中Bcl-2及Bax蛋白表达水平为(466.81±10.18、291.00±8.95)。青蒿琥酯组中Bcl-2蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)，而Bax蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。且具有Art剂量依赖性。

2.3Art下调SGC-7901细胞线粒体膜电位表达水平 30、60、120 μmol/L Art组SGC-7901细胞线粒体膜电位表达水平(489.34±3.49、473.19±3.01、442.54±4.59)显著低于对照组(500.80±2.65)，(P<0.05)，且具有剂量依赖性。

2.4Art上调SGC-7901细胞中Caspase-3蛋白表达水平 30、60、120 μmol/L Art组SGC-7901细胞中Caspase-3蛋白表达水平(363.44±7.46、391.90±4.32、426.34±4.08)显著高于对照组(335.82±8.16，P<0.05)，且具有剂量依赖性。

3 讨 论

胃癌是发病率较高的消化道恶性肿瘤〔12〕，且病死率高〔13〕，手术、放疗及化疗等是胃癌的常规治疗方法。胃癌发病过程隐匿，一般患者就诊时已是中晚期，错过手术的最佳时机，化疗就成为其主要的治疗方法之一。影响化疗效果的最主要因素包括，化疗药物的高毒副作用及化疗药物的多药耐药〔14〕。

本课题小组在以往的研究中发现，Art具有抑制食管癌细胞生长的作用，并初步探究了其作用机制与诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡有关。文献显示，Art对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用〔7〕，但目前在胃癌中的相关研究少有报道，且作用机制尚未阐明。

细胞凋亡调控的稳态对于维持正常组织的功能具有重要意义，一旦平衡被打破，就会引起疾病发生，包括肿瘤的发生。肿瘤细胞在其发生及发展过程中，细胞凋亡机制往往被抑制，导致肿瘤细胞的旺盛增殖能力。鉴于凋亡与肿瘤发生有如此密切关系，目前开发新抗癌药物时，将药物能否诱导肿瘤细胞凋亡作为判断药物是否有效的重要评价指标。

实验中观测到青蒿琥酯干预SGC-7901细胞后，出现细胞凋亡，且随着青蒿琥酯浓度的增加，诱导细胞凋亡作用越强。提示了青蒿琥酯具有诱导胃癌细胞凋亡作用。这与本课题组以往研究的青蒿琥酯具有诱导食管癌细胞凋亡作用〔15,16〕相一致。

线粒体是细胞生命活动控制中心，是细胞凋亡重要调控中心。细胞线粒体的跨膜电位降低可以诱导细胞色素C等释放，活化Caspase 蛋白酶家族，引起细胞凋亡的级联反应，使细胞进入不可逆的凋亡过程。Bcl-2可以稳定细胞线粒体膜电位，防止线粒体膜电位的耗散，起到抑制细胞凋亡的作用。而Bax则可导致线粒体膜电位的耗散，从而促进细胞凋亡。本研究结果显示，Art可以降低细胞线粒体膜电位水平。同时也检测到Art可以抑制SGC-7901细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax及Caspase-3蛋白的表达。提示，Art可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡。