KNDC1功能的研究进展

孙靖玉 林雅军 (北京医院国家老年医学中心 卫生部老年医学重点实验室，北京 100730)

激酶非催化C-叶结构域蛋白(KNDC)1又称V-KNDC1(KIND)、RASGEF2、C10orf23、Very-KIND、bB439H18.3，是近年来发现的新基因，在脑的不同区域表达水平不同，尤其在小脑颗粒细胞中表达最高〔1〕。其在许多信号传导通路的蛋白间分子识别和功能调控中扮演重要角色〔2〕。研究表明，KNDC1与神经元树突的生长、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的衰老及纤维核心蛋白的修饰有关，有望成为新的研究热点。本文将 KNDC1 这一新调控因子的结构特点与其功能作用及其机制进行综述。

1 KNDC1概况

1.1KNDC1的发现 KIND从催化蛋白激酶折叠进化成用于信号蛋白的潜在蛋白质相互作用模块。 Spir家族肌动蛋白和13型非受体磷酸酶(PTP 13型)在蛋白质的very-N-末端部分编码KIND结构域。Mees等〔3〕报道了KIND蛋白家族第三个成员的表征和克隆，由于其含有两个KIND结构域，将其命名为very-KIND(V-KIND)。其后，Huang等〔4〕也报道了KNDC1对神经元树突生长调节的机制。

1.2KNDC1的分布 哺乳动物基因组中只有一个V-KIND基因，到目前为止只在脊椎动物中发现了该基因。为确定所有编码蛋白质基因的组织特异性，对代表27种不同组织的95个人类个体的组织样本进行RNA-seq检测〔5〕，结果显示KNDC1在脑、卵巢、肾上腺、子宫内膜、睾丸、甲状腺等均有表达。Mees等〔3〕发现，在小鼠胚胎发生过程中，V-KIND基因在发育中的神经系统中特异性表达。在成年小鼠中，V-KIND仅在脑中高表达，在卵巢中可以检测到低表达。V-KIND主要在小脑颗粒和浦肯野细胞层的神经元细胞中特异性表达。李开济等〔2〕在人脐血管内皮细胞中也检测到KNDC1的表达。

1.3KNDC1的结构特点 人KNDC1基因位于10q26.3，长约65 959 bp，共有4个转录变异体，其中变异体1最长，翻译后的蛋白质分子量约为54 191 kD，在239个有机体中具有人类基因KNDC1，其在恒河猴、小鼠、大鼠、鸡和青蛙中保守性很强。KIND是公认的蛋白质-蛋白质相互作用模块。迄今为止，发现的含KIND的蛋白质有4种，肌动蛋白 -核因子(Spir-2)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPN13)，支架蛋白(FRMPD2)和V-KIND(脑特异性Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子)。 其中V-KIND有2个KIND域(KIND1和KIND2)，而其他3个蛋白只有一个〔6〕。与蛋白质家族的其他成员一样，V-KIND在N末端具有KIND结构域。第2个KIND结构域位于蛋白质的中心部分。 C-末端半编码Ras样GTP酶(RasGEF)和RasGEF N-末端模块(RasGEFN)的鸟嘌呤核苷酸交换因子结构示意图如图1。

图1 KNDC1结构

2 KNDC1与神经元树突的生长

大脑特异性RasGEF V-KIND 是小脑颗粒细胞正常树突生长和适当的运动协调所必须的。

2.1KNDC1负调控神经元树突的生长 V-KIND过表达和RNAi敲低实验表明，V-KIND在控制树突生长中有重要作用，尽管潜在的分子机制仍然难以阐明〔1，6〕。前期研究表明，V-KIND的 RasGEF活性通过c-JUN氨基末端激酶(JNK)1和(或)细胞外信号调控激酶(ERK)，经由 Ras-Raf-MAPK通路诱导微管关联蛋白(MAP)2的磷酸化，MAP2磷酸化后与微管结合的活性增加，可以促进神经细胞树突的长度增加，研究还发现抑制或敲低V-KIND的表达可以促进培养中的小脑颗粒细胞和海马神经元的树突生长，这表明其作为一种信号分子在发育过程中调控或抑制神经元树突生长〔7〕。同时，KNDC1基因敲除小鼠运动功能没有显著变化，但年轻的基因敲除小鼠的握力有明显增加，且在平衡相关试验中运动操作性能展现出更好的趋势。

2.2KNDC1调控树突的生长的机制 最初研究假设KNDC1调控树突的生长机制可能是V-KIND和MAP2之间的物理和功能关联，即V-KIND-MAP2相互作用和V-KIND诱导的MAP2 Thr磷酸化。MAP2是一种树突状微管相关蛋白，在神经元树突生长中起负调控作用。在树突发展过程中，早期的树枝状伸长和后期的树枝状成熟都需要正常的MT结构。 MAP2磷酸化水平在发育上受到树突生长的控制〔8，9〕。 MAP2的磷酸化增加造成MAP2从MT分离，从而导致MT稳定性降低和肌动蛋白束活性减弱〔10～14〕。Huang等〔4〕研究显示V-KIND过表达促进MAP2 Thr磷酸化并导致树突生长受损，而V-KIND RNAi敲低降低MAP2 Thr磷酸化并诱导树突生长增加。此外，MAP2结合结构域KIND2单独作为显著的负调控因子，其过表达最终增加树突长度和复杂性。以上表明V-KIND可能通过在树突发育过程中控制MAP2磷酸化水平起作用。见图2。

图2 KNDC1调控树突生长的机制

Huang等〔4〕通过生成一系列突变构建体来分析v-KIND-MAP2相互作用的结构-功能关系。在4种含KIND的蛋白质(Spir-2，PTPN13，FRMPD2和V-KIND)中的KIND结构域中，只有V-KIND的KIND2结构域特异性结合MAP2。 值得注意的是，在海马神经元中表达的32个残基的V-KIND MAP2结合核心多肽在促进树突分支方面非常有效，这与V-KIND过表达的效果相反，但类似于V-KIND的敲低效应〔14〕，表明32个氨基酸核心多肽通过与内源性V-KIND竞争MAP2结合位点而充当显性负调节分子。先前的体外研究表明，V-KIND的RasGEF活性通过激活Ras-Raf-MAP激酶途径诱导JNK1和(或)ERK促进 MAP2 磷酸化〔7〕。JNK1对MAP2的磷酸化作用(如V-KIND过表达的下游〔14〕)增强了MAP2与微管的结合并促进其组装的活性〔15〕，并且对JNK1的抑制(如V-KIND 敲低下游〔14〕)增加了树突分支的数量，但缩短了树突的平均长度〔16〕。对V-KIND-MAP2相互作用关键的结合核心模块定义在小鼠V-KIND KIND2的32个残基内和小鼠MAP2中心结构域的43个残基内。 KIND2的MAP2结合核心模块中氨基酸461、474和477处的3个Leu残基促成了相互作用。 MAP2结合核心模块本身作为海马神经元中V-KIND的显性负调节因子促进树突分支。综上，KIND2结构域通过V-KIND RasGEF(Ras途径的激活剂)靶向与树突微管细胞骨架相关的MAP2结合来调节树突复杂性。

总之，V-KIND和MAP2相互作用核心模块在调节海马神经元和小脑颗粒细胞树突生长和分支的结构和功能上起重要作用。对这些新鉴定的蛋白质-蛋白质相互作用核心模块的进一步研究，包括三级结构分析，将进一步阐明V-KIND-MAP2相互作用调节树突树枝状模式的分子机制，这对于塑造神经元通路至关重要，同时也可能是为理解某些MAP2相关的神经退行性疾病和精神疾病提供线索〔2，17〕。

3 KNDC1对HUVEC衰老作用的影响

KNDC1作为一种新型RasGEF蛋白，已被认为 是一个与细胞衰老相关蛋白〔3〕。研究发现，KNDC1过表达会加速HUVEC衰老〔7〕，而敲低则会延缓其衰老〔18〕。

3.1KNDC1过表达促进HUVEC衰老的作用机制 李开济等〔2〕通过构建人KNDC1腺病毒表达载体，观察其在HUVEC中的表达及功能，证明了KNDC1过表达能够诱导HUVEC衰老，且表现出明显量效关系。姬劲锐等〔7〕在载体构建成功的基础上，进一步对KNDC1促细胞凋亡的机制进行了研究，研究表明，KNDC1过表达通过启动p53信号通路增加活性氧簇(ROS)表达。p53-ROS 正反馈环在调控KNDC1介导的细胞衰老中发挥重要作用，通过增加磷酸化p53蛋白的表达，KNDC1促进p53表达并放大p53-ROS反馈环的作用，进而加速细胞衰老的进程。因此，KNDC1在介导细胞衰老过程中的完整信号通路应该继续研究，这将为衰老相关疾病提供新的治疗方向。

3.2敲低KNDC1能预防HUVEC衰老的作用机制 Zhang等〔18〕研究表明，敲低KNDC1促进HUVEC的增殖并延缓衰老。 其作用机制为：KNDC1的敲低通过抑制p53-p21-p16信号传导途径增加了S和G2/ M期细胞的百分比。 此外，KNDC1的敲低增加了内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达并改善了毛细管网络的形成。 因此，敲低KNDC1有助于延迟内皮细胞衰老，表明KNDC1有可能成为药物开发中的新靶点，延缓衰老过程，延长人类寿命。

4 KNDC1对禽蛋壳超微结构的影响

Duan等〔19〕发现KNDC1与乳头密度(MD)显著相关，认为KNDC1可能参与纤维核心蛋白质修饰，这决定了纤维核心是否是成核位点。 KNDC1对MD的确切功能作用仍有待阐明。对此提出了两种方法来说明KNDC1的功能：直接方式，KNDC1直接与纤维核心蛋白相互作用；间接方式，KNDC1通过参与信号转导来修饰纤维核心蛋白。MD可以通过KNDC1介导的在成核位点直接或间接修饰纤维核心蛋白来调节。研究KNDC1对蛋壳超微结构的遗传影响，有助于提高蛋壳质量，有助于对鸡蛋壳及其他生物矿化材料的超微结构和生物矿化的理解。

综上所述，KNDC1功能与神经元树突生长、HUVEC衰老、禽蛋壳超微结构密切相关，深入研究其功能和作用机制有可能为治疗神经退行性疾病、抗衰老药物研发、生物矿化材料提供更多信息。