湘西峒河流域星齿蛉幼虫分子鉴定与体表呼吸结构观察

潘凤溜，瞿玉国，张佑祥，向 颖，赵驰珺，曹成全,3，黄兴龙*

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，吉首 416000；2.古丈县农业农村局，湘西 416300；3.乐山师范学院生命科学学院，乐山 614004)

星齿蛉属Protohermes隶属于昆虫纲Insecta广翅目Megaloptera齿蛉科Corydalidae，是齿蛉亚科Corydalinae最大的属(Liuetal.,2013)。我国是星齿蛉种类最丰富的国家，目前已知超过38种，占全世界已知种类的70%(Liuetal.,2006)。星齿蛉是原始的完全变态昆虫，幼虫水生，蛹和成虫陆生(Hayashietal.,1988)，幼虫大多栖息于生态环境优越的河流溪沟中，对水质变化敏感，因此星齿蛉也被广泛用于淡水生态系统的水质监测(王备新和杨莲芳，2004；杨定和刘星月，2010)。星齿蛉幼虫体表具有多种呼吸结构，胸部和腹部分别具有2对和8对气门，1～8腹节各具有一对气管鳃；此外，1～7腹节气管鳃下方还具有毛簇(杨定和刘星月，2010)。在鞘翅目和蜻蜓目的研究中发现，具有气管鳃的水生昆虫，主要以气管鳃进行气体交换获取生命活动所需的O2(郑霞林等，2007；马龙和张明峰，2012)。Barclay等(2005)对齿蛉亚科新齿蛉属Corydalus昆虫的研究发现，Corydaluscornutus幼虫毛簇具有大量纤毛，每条纤毛中具有一条气管，并推测毛簇是新齿蛉属幼虫的主要呼吸结构。星齿蛉属为齿蛉亚科中最大的属，但是关于星齿蛉幼虫体表呼吸结构观察的报道比较缺乏。

峒河，也被称作武水，是湘西土家族苗族自治州南部的主要河流，源头位于花垣县雅酉镇，于泸溪县武溪镇汇入沅江，干流总长约150 km，主要支流包括洽比河、龙午河、司马河和丹清河(朱程等，2010)。峒河流域植被覆盖率高，动植物种类极为丰富，是我国生态安全建设和生态扶贫的重点区域(邵佳和冷志明，2016)。同时，峒河流域也是土家族和苗族聚居区域。当地少数民族群众常在河流、溪沟中捕捞和食用俗称“桃花虫”和“水蜈蚣”的水生昆虫(贾维秀，2016)。这些昆虫食品也是苗族百虫宴的核心内容之一。实地调查发现，桃花虫和水蜈蚣是多种水生昆虫的统称，桃花虫主要指蜻蜓目稚虫，水蜈蚣主要指星齿蛉幼虫。因此星齿蛉在当地生态系统和少数民族文化中具有重要地位。但是，目前峒河流域的星齿蛉种类还不明确。

线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列广泛用于昆虫的系统地位和系统发育关系分析(张丹丹等，2017)。星齿蛉幼虫形态与其他齿蛉亚科幼虫形态相似，传统的星齿蛉分类鉴定主要通过观察成虫的形态学特征。近年来，星齿蛉属昆虫的分子生物学研究不断深入，文献报道了Protohermesconcolorus线粒体基因组和67条星齿蛉属昆虫COⅠ基因片段序列信息，使基于COⅠ基因的星齿蛉属昆虫分子鉴定成为可能(Huaetal.,2008；Changetal.,2013)。Jung等人(2016)的研究证实，COⅠ基因序列可作为DNA条形码，用于广翅目幼虫的分类鉴定。本研究通过COⅠ基因序列分析对峒河流域星齿蛉幼虫进行了鉴定，并对其体表呼吸结构进行了观察，以期为星齿蛉的保护和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 昆虫采集和形态学观察

本研究于2018年9-10月对峒河流域进行星齿蛉幼虫采集，样线涵盖峒河干流以及支流洽比河、龙午河、司马河和丹青河。峒河及其支流两岸为山地，植被覆盖率高，村落和农田沿河分布。每条河流选取3个样点，每个样点选取2 m×2 m的样方3个。单个样方由1人使用宽度30 cm、网孔2 mm的D形网捕捞15 min，然后以样方为单位将捕获的星齿蛉幼虫放入打孔的塑料盒，带回实验室数量统计。部分幼虫直接用于形态特征观察，然后进行DNA提取或浸泡在80%酒精中，于4℃冰箱长期保存。其余幼虫在室内饲养，并在2019年6月羽化获得成虫，对成虫进行了形态学鉴定。使用外接数码相机(D810，尼康)的体视显微镜(XTL-165-VT，凤凰)进行形态学观察和拍照，照片由Photoshop 7.0软件(Adobe)进行裁切和图层叠加。用于观察气管分布情况的星齿蛉幼虫新鲜标本浸泡于含0.03% Triton X-100和0.85% NaCl磷酸缓冲液中，4℃放置24 h。形态学特征描述参考杨定和刘星月(2010)。

1.2 PCR扩增

按照EasyPure Genomic DNA Kit(北京全世金)试剂盒说明书的操作步骤提取幼虫一侧中足和胸部肌肉组织DNA。用于COⅠ基因扩增的通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上下游引物序列分别为(P3:5′-CAACATTTATT TTGATTTTTTGG-3′)和(P4:5′-TCCATTGCACT AATCTGCCATATTA-3′)(Yangetal.,2017)。PCR反应体系为25 μL，包含PCR Mastermix(北京康为世纪)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃退火45 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经10%琼脂糖凝胶电泳检测后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3 序列分析

测序结果通过NCBI网站的Blastn服务(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行相似性比较，确定PCR扩增得到的序列是否来自齿蛉科昆虫。使用Clustal X 1.83软件进行多重序列比对(Thompsonetal.,1997)。通过Mega 5.0软件计算星齿蛉COⅠ基因序列的遗传距离。使用Mega 5.0软件构建系统发育树，采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)和最大似然法(Maximum likelihood,ML)，重复1 000次(Tamuraetal.,2011)。用于构建系统发育树的COⅠ基因序列除来自峒河流域星齿蛉标本外，还包括Genbank中齿蛉亚科昆虫的COⅠ基因序列，分别来自巨齿蛉属Acanthacorydalis、齿蛉属Neoneuromus,以及星齿蛉属的花边星齿蛉种团和炎黄星齿蛉种团(表1)。

2 结果与分析

2.1 峒河流域星齿蛉

通过对峒河干流及其4条支流进行了水生昆虫采集，共发现两种外部形态存在差异的星齿蛉幼虫，星齿蛉A和星齿蛉B(表2)。洽比河、司马河和丹清河，两种星齿蛉幼虫均有分布；而在峒河干流和龙午河仅发现星齿蛉A。星齿蛉幼虫在室内羽化得到的成虫经形态学鉴定，星齿蛉A为花边星齿蛉Protohermescostalis和星齿蛉B为炎黄星齿蛉Protohermesxanthodes。

2.2 遗传距离

选取3头星齿蛉A标本(P001、P002和P003)和2头星齿蛉B标本(P004和P005)用于DNA提取和COⅠ基因序列分析。P001、P002和P003 COⅠ基因序列与Genbank中的花边星齿蛉COⅠ基因序列同源性达到99%，初步认定为花边星齿蛉；P004和P005 COⅠ基因序列与炎黄星齿蛉COⅠ基因序列同源性为99%，初步认定为炎黄星齿蛉。

利用MEGA 5.0软件计算峒河流域星齿蛉标本COⅠ基因序列与Genbank中花边星齿蛉种团和炎黄星齿蛉COⅠ基因序列的遗传距离(表3)。花边星齿蛉种团内种间遗传距离在0.060～0.095之间，花边星齿蛉种团各种与炎黄星齿蛉种间遗传距离为0.085～0.106。P001、P002和P003之间的遗传距离在0.012～0.030，低于种间遗传距离；三者与花边星齿蛉遗传距离分别为0.016、0.033和0.020，也低于种间遗传距离，说明P001、P002、P003与花边星齿蛉为同一物种。P004和P005遗传距离为0.04，低于种间遗传距离；二者与炎黄星齿蛉的遗传距离分别为0.009和0.011，也低于种间遗传距离，说明P004和P005属于炎黄星齿蛉。

表1 用于系统发育分析的齿蛉亚科COⅠ基因序列Table 1 COⅠ gene sequences of Corydalinae used in the phylogenetic analysis

2.3 系统发育分析

以齿蛉亚科3属(星齿蛉属、齿蛉属和巨齿蛉属)的COⅠ基因构建系统发育树。NJ法和ML法构建的系统发育树中，星齿蛉属、齿蛉属和巨齿蛉属均各自聚为一支(图1:A,B)；P001、P002、P003、P004和P005位于星齿蛉属昆虫构成的分支；其中P001、P002、P003位于花边星齿蛉种团，与花边星齿蛉聚为一支；P004和P005与炎黄星齿蛉聚为一支。综合考虑遗传距离分析结果和系统发育分析结果，峒河流域采集的星齿蛉A和B分别属于花边星齿蛉和炎黄星齿蛉。

表2 样点星齿蛉幼虫数量Table 2 Number of Protohermes larvae in the sample sites

表3 基于COⅠ基因序列的星齿蛉遗传距离Table 3 Genetic distance of Protohermes based on COⅠ gene sequence

图1 基于COⅠ基因的系统发育树Fig.1 Phylogenetic treesbased on COⅠ gene sequence注：A,基于COⅠ基因的NJ树;B,基于COⅠ基因的ML树。Note:A,NJ trees based on COⅠ gene sequence;B,ML trees based on COⅠ gene sequence.

2.4 外部形态

炎黄星齿蛉幼虫体长50.0～53.6 mm，体粗长，略扁(图2:A,B)。头部方形，深棕色或棕色，表面光滑，背面具有黄色花(图2:C)；上唇三角形，上颚发达，具有4个小齿；触角5节，第3节较长，端部两节较短。前胸背板方形，与头部等宽，深棕色或棕色，具有黄色斑纹(图2:E)；头部背面和前胸背板斑纹形状在个体间存在一定差异，同一个体左侧和右侧斑纹也存在细微变化。中胸和后胸背面浅棕色，具有黄色斑纹(图2:F)。前胸与中胸之间、中胸与后胸之间各具有1对气孔。腹部10节，表面具有大量刚毛；1-8腹节各具有一对气管鳃，鞭状，表面具有刚毛，第8腹节气管鳃刚毛较长呈羽状；每条气管鳃基部前方具有1个气孔；1-7腹节气管鳃下具有浓密的白色毛簇，第8腹节气管鳃下无毛簇(图2:H)；第9腹节无特化的结构；第10腹节具一对钩状臀足，臀足末端具2个爪，臀足外侧具1刺突，形状与第8腹节气管鳃相似，呈羽状，但更短小(图2:H)。

花边星齿蛉幼虫体长46.2～51.7 mm，体粗长，略扁(图2:I,J)。头部方形，浅棕色，背面斑纹黄色；上唇三角形，上颚发达，具4个小齿(图2:K)；触角5节，端部两节较短，第三节较长。前胸背板与头部等宽，或略宽于头部，斑纹不明显(图2:M)。中胸和后胸背面浅棕色，具有黄色斑纹(图2:N)。前胸与中胸之间、中胸与后胸之间各具有1对气孔。腹部10节，表面具有大量刚毛；1-8腹节各有一对鞭状气管鳃，表面具有刚毛；每条气管鳃基部前方具有1个气孔，1-7腹节气管鳃下方具棕色或白色毛簇，第8腹节气管鳃下无毛簇(图2:P)；第9腹节无特化结构；第10腹节具一对钩状臀足，臀足末端具有2个小爪，臀足外侧具1鞭状刺突，形状与气管鳃相近，但更短小纤细(图2:P)。

图2 炎黄星齿蛉和花边星齿蛉幼虫Fig.2 Larvae of Protohermes xanthodes and Protohermes costalis 注:A,炎黄星齿蛉幼虫背面观;B,炎黄星齿蛉幼虫腹面观;C,炎黄星齿蛉头部背面观;D,炎黄星齿蛉头部腹面观;E,炎黄星齿蛉前胸背板;F,炎黄星齿蛉中胸、后胸背面;G,炎黄星齿蛉7-10腹节背面;H,炎黄星齿蛉7-10腹节腹面观;I,花边星齿蛉幼虫背面观;J,花边星齿蛉幼虫腹面观;K,花边星齿蛉头部背面;L,花边星齿蛉头部腹面;M,花边星齿蛉前胸背板;N,花边星齿蛉中胸后胸背面;O,花边星齿蛉7-10腹节背面;P,花边星齿蛉7-10腹节腹面。Note:A,dorsal view of P.xanthodes larva;B:ventral view of P.xanthodes larva;C,dorsal view of P.xanthodes larva head;D:ventral view of P.xanthodes larva head;E,pronotum of P.xanthodes larva;F,mesothorax and metathorax of P.xanthodes larva;G,dorsal view of 7～10 abdominal segment of P.xanthodes larva;H,ventral view of 7～10 abdominal segment of P.xanthodes larva;I,dorsal view of P.costalis larva;J:ventral view of P.costalis larva;K,dorsal view of P.costalis larva head;L,ventral view of P.costalis larva head;M,pronotum of P.costalis larva;N,mesothorax and metathorax of P.costalis larva;O,dorsal view of 7～10 abdominal segment of P.costalis larva;P,ventral view of 7～10 abdominal segment of P.costalis larva.

2.5 体表呼吸结构

炎黄星齿蛉和花边星齿蛉幼虫腹部具有8对气门，分别位于第1至第8腹节(图3:A,I)。胸部具有2对气门，分别位于中胸和后胸前端，后胸气门较小；中胸气门较大(图3:B,J)。腹部和胸部气门均具有单瓣式开闭机构，胸部气门开闭机构位于气孔后沿(图3D,L)，腹部气门开闭机构位于气孔前沿(图3:E,F,M,N)。沿气门剪开体壁，可以观察到胸部和腹部气门均与内部气管相连。

两种星齿蛉第1至第8腹节均具有1对气管鳃，第十腹节臀足外侧具有1对气管鳃状刺突，第1至第7腹节气管鳃下方具有浓密的气管鳃毛簇。观察发现，炎黄星齿蛉毛簇由两丛小簇组成；小簇包含大量细长的纤毛，每条纤毛中均具有一条银色的气管(图3:H)。花边星齿蛉毛簇也由两丛小簇组成，由于体壁颜色较浅，可以观察到小簇基部与大量银色微气管相连，这些微气管向纤毛延伸，直到纤毛端部(图3:O)。而花边星齿蛉气管鳃和臀足只观察到一条银色的气管(图3:H)。

图3 炎黄星齿蛉和花边星齿蛉幼虫体表呼吸结构Fig.3 Surface respiratory structures of Protohermes xanthodes and Protohermes costalis larva注:A,炎黄星齿蛉幼虫腹部体表呼吸结构;B,炎黄星齿蛉幼虫胸部体表呼吸结构;C,炎黄星齿蛉幼虫气管腮;D,炎黄星齿蛉幼虫中胸气门;E和F,炎黄星齿蛉幼虫1-2腹节气门;G,炎黄星齿蛉幼虫毛簇;H,炎黄星齿蛉幼虫毛簇纤毛;I,花边星齿蛉幼虫体表呼吸结构;J,花边星齿蛉幼虫胸部体表呼吸结构;K,花边星齿蛉幼虫气管腮;L,花边星齿蛉幼虫中胸气门;M和N,花边星齿蛉幼虫1-2腹节气门;O,花边星齿蛉幼虫毛簇;P,花边星齿蛉幼虫毛簇纤毛。简称:As,腹部气门;Ts,胸部气门;Tg,气管鳃;Tgt,毛簇;Tr,气管;Fi,毛簇纤毛。Note:A,surface respiratory structures in abdomen of P.xanthodes larva;B,surface respiratory structures in thorax of P.xanthodes larva;C,tracheal gill of P.xanthodes larva;D,spiracle in mesothorax of P.xanthodes larva;E and F,spiracle in 1～2 abdominal segment of P.xanthodes larva;G,tracheal gill tuft of P.xanthodes larva;H,tracheal gill tuft filaments of P.xanthodes larva;I,surface respiratory structures in abdomen of P.costalis larva;J,surface respiratory structures in thorax of P.costalis larva;K,tracheal gill of P.costalis larva;L,spiracle in mesothorax of P.costali larva;M and N,spiracle in 1～2 abdominal segment of P.costalis larva;O,tracheal gill tuft of P.costalis larva;P,tracheal gill tuft filaments of P.costalis larva.Abbreviations:As,abdominal spiracle;Ts,thoracic spiracle;Tg,tracheal gill;Tgt,tracheal gill tuft;Tr,trachea;Fi,filament.

3 结论与讨论

COⅠ基因被广泛用于昆虫的系统地位和系统发育研究，是DNA条形码选用的主要基因之一，可在昆虫生长发育的不同阶段对其进行鉴定(陈珊等，2017)。本研究发现，湘西峒河流域星齿蛉幼虫的COⅠ基因片段分别与花边星齿蛉和炎黄星齿蛉COⅠ基因一致性最高。后续的遗传距离分析发现，花边星齿蛉种团和炎黄星齿蛉范围内的种间遗传距离为0.060～0.106，而P001、P002、P003与花边星齿蛉的遗传距离不超过0.033，低于种间遗传距离；P004、P005与炎黄星齿蛉的遗传距离也低于种间遗传距离，由此推测P001、P002和P003属于花边星齿蛉，P004和P005属于炎黄星齿蛉。为了验证遗传距离分析结果，本研究用齿蛉亚科昆虫3属(星齿蛉属、齿蛉属和巨齿蛉属)的COⅠ基因构建了系统发育树，COⅠ基因片段的分支情况与属级分类地位一致。Jung等(2016)使用鱼蛉科和齿蛉科昆虫COⅠ基因片段构建的系统发育树分支也得到了与本研究类似的结果，各分支与物种的属级分类地位一致，来自同一物种的COⅠ基因聚为一支。P001、P002和P003与花边星齿蛉聚为一支，P004和P005与炎黄星齿蛉聚为一支，该结果进一步证实峒河流域采集的星齿蛉幼虫分别属于花边星齿蛉和炎黄星齿蛉。

花边星齿蛉和炎黄星齿蛉为我国广布种。花边星齿蛉主要分布于东洋界，分布范围包括云南、贵州、湖北、湖南、江西、安徽、浙江、福建、广西、广东和台湾，在河南商城也有发现(Liuetal.,2007)。炎黄星齿蛉分布范围涵盖东洋界和古北界，包括辽宁、北京、河北、山西、山东、甘肃、陕西、云南、贵州、四川、重庆、河南、湖南、湖北、江西、安徽、浙江、广西和广东(Liuetal.,2006)。本研究的野外采集发现，洽比河、司马河和丹青河两种星齿蛉均有分布，峒河干流和龙午河仅发现花边星齿蛉。丹青河水量充沛，上游位于高望界国家级自然保护区。该保护区自然环境优越，人类活动干扰小，动植物多样性极高，保护区生物多样性对保持丹青河星齿蛉多样性可能有积极作用。峒河干流流经矮寨镇和吉首市区，河流沿线居民区和工农业设施较多，部分河段存在严重的污染问题(朱程等，2010)。人类活动引起的水质污染可能是峒河干流星齿蛉数量少和种类单一的重要原因。龙午河是峒河较小的一条支流，干流长度不足20 km，在枯水季节常常出现断流；花边星齿蛉在龙午河种群数量较大，但未发现炎黄星齿蛉。因此推测，河水干枯可能是影响龙午河星齿蛉多样性的重要因素，花边星齿蛉可能比炎黄星齿蛉更能适应河水断流的自然情况。花边星齿蛉和炎黄星齿蛉在洽比河和司马河均有分布。洽比河和司马河上游位于保靖县吕洞山区，吕洞山被苗区人民称为圣山，自然环境优越，人类活动干扰较小(刘晓蓉，2018)。综上，河流污染和断流可能是影响星齿蛉种群数量的重要因素，水量充沛、水质清洁的河流更有利于星齿蛉生存。

水生昆虫由陆生昆虫演化而来，因此水生昆虫均保留了气管呼吸系统(Lee,1929;郑霞林等，2008)。齿蛉科包括齿蛉属和星齿蛉属，它们的幼虫均为淡水生，具有发达的气管呼吸系统。曹成全等(2010)研究齿蛉属普通齿蛉Neoneuromusignobilis幼虫的呼吸系统，发现普通齿蛉具有两条较粗的侧纵干气管，侧纵干气管分支而来的二级气管与气门、毛簇相连。本研究在星齿蛉属幼虫上也观查到了气管呼吸系统，花边星齿蛉体表的10个气门均与气管相连，毛簇、气管鳃和臀足侧突中均具有气管；对炎黄星齿蛉和花边星齿蛉毛簇的观察还发现，毛簇基部具有大量微气管，这些微气管从毛簇纤毛的基部向上延伸，一直到达纤毛的端部。Barclay等(2005)使用扫描电镜观测了新齿蛉属昆虫C.cornutus毛簇纤毛横切面，发现C.cornutus毛簇纤毛的主体是贯穿其中的微气管，微气管螺旋状內脊使纤毛具有足够的刚性抵抗水压；同时纤毛表面具有密集的褶皱，这些褶皱增加了纤毛与水的接触面积，有利于纤毛与水介质的气体交换。齿蛉亚科幼虫毛簇还与一条收缩肌相连，可以有节律的摆动，以促进毛簇与水介质的气体交换(Bitsch,2012)。炎黄星齿蛉和花边星齿蛉幼虫的毛簇在水中也会进行这样的摆动。本研究推测，星齿蛉与齿蛉类似，纤毛中的微气管使纤毛在水压下保持贯通，水介质中溶解的氧气能够穿过纤毛进入微气管，然后通过气管系统传递到整个虫体。对花边星齿蛉气管鳃和臀足侧突的观察发现，这些结构中具有一条比纤毛微气管略粗的气管。由此推测，气管鳃和臀足侧突也具有气体交换的功能，但呼吸效率远不如毛簇。综上，本研究认为星齿蛉幼虫在水下主要通过毛簇纤毛获取水中的氧气，毛簇是星齿蛉幼虫在水下呼吸的主要结构。