没食子酸对美国白蛾幼虫营养效应及解毒酶活性的影响

武 磊，李路莎，王立颖，袁郁斐，陈 敏*

(1.北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室，北京 100083；2.承德市围场满族蒙古族自治县林业局，河北承德 068450)

在植物-昆虫互作过程中，一方面植物为植食性昆虫的生长发育提供营养需求，同时，植物通过多种方式抵抗昆虫的取食(Rani and Jyothsna，2010;Waretal.，2011a;2011b)。其中，次生代谢物在植物抵御昆虫的取食中发挥着重要的作用。酚类是最广泛的植物次生代谢物之一，主要包括植物多酚、黄酮类、萘醌、苯醌和木质素等(张力平等，2005;张雅静，2014)。次生代谢物通常对昆虫的取食、生长发育和繁殖等生命活动产生不利影响，甚至具有毒杀的效果(王亚军等，2017)。

在长期的进化过程中，昆虫同样形成了行为、生理和生化等多种防御机制来抵御这些有毒次生物质对其造成的影响(彭露等，2010)。昆虫在遭受植物次生代谢物质的毒害时，能够利用体内自身的解毒酶系进行解毒排毒(王瑞龙等，2012)，如羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和昆虫细胞色素P450(P450)等。此外，乙酰胆碱酯酶(AchE)在植物-昆虫互作过程中发挥重要的作用(王莹，2008)，主要参与昆虫突触传导，是杀虫剂作用的重要靶点(Vanetal.，2005;王瑞龙等，2012)。生物化学及分子水平研究证实，昆虫对植物次生物质的代谢能力与昆虫的寄主范围密切相关(陈澄宇等，2015)。如杂食性昆虫棉铃虫Helicoverpaarmigera的CYP6B8能够代谢花椒毒素、槲皮素、黄酮、绿原酸、吲哚3-甲醇和芸香苷等多种植物次生物质(Lietal.，2004)，而寡食性昆虫北美黑凤蝶Papiliopolyxenes的CYP6B1仅能够有效代谢线型和角型呋喃香豆素，对黄酮、α-萘黄酮的代谢能力较弱(Wenetal.，2003)。这表明与寡食性昆虫相比，杂食性昆虫具有更为强大的解毒酶体系(Ramseyetal.，2010)。

美国白蛾Hyphantriacunea原产北美洲，属于鳞翅目Lepidoptera灯蛾科Arctiidae(Sullivanetal.，2011)。1979年在我国辽宁省丹东市首次发现美国白蛾(Yangetal.，2006;Chenetal.，2014)，目前已经扩散至11个省(区、市)共计572个县级行政区(国家林业局2018年第3号公告)。美国白蛾寄主非常广泛，世界范围内寄主植物多达630余种(Sullivan and Ozman-Sullivan，2012)，中国地区的寄主植物超过300种(王凤琴和桑成武，2008)。该害虫被列为中国最重要的森林检疫性有害生物之一(Zhangetal.，2016)。目前关于美国白蛾的生物生态学、种群遗传学、性信息素开发及防治技术等方面已开展广泛研究(Gomi，2007；Kimetal.，2011；Kiyotaetal.，2011；刘颉等，2012；Zibaeeetal.，2013；Caoetal.，2016)。但关于该害虫对环境和广泛寄主植物的适应机制的研究却鲜有涉及。前期研究发现，美国白蛾幼虫对不同寄主植物存在取食选择和营养效应差异，取食不同寄主植物的美国白蛾幼虫AchE、GSTs、CarE和P450的活性存在显著差异(李路莎等，2018)。由于不同寄主植物所含次生代谢物的种类以及各类次生物质的含量各异，难以明确单一种类的次生物质对美国白蛾生理代谢的影响。

没食子酸gallic acid是一种天然有机酚酸，具有多酚类和酸类物质的通性(Kimetal.，2006；Kangetal.，2008；Giftsonetal.，2009)，是植物防御植食性昆虫的一种重要的抗虫次生代谢物(Coruh and Ercisli，2010；黄敏燕和李雪峰，2018)，广泛存在于大叶桉、杨、桑等常见植物的叶片中(柯发敏和张开莲，2011；理永霞等，2011；丁双华，2011)。陈巨莲等(2003)研究发现没食子酸对麦长管蚜Sitobionavenae的存活、生长和发育具有明显的抑制作用，同时还对蔗糖酶、CarE和GSTs等多种解毒酶的活力表现出不同的作用效果。没食子酸能够显著抑制青杨天牛Saperdapopulnea幼虫体内CarE的活性，减弱CarE的解毒功能(谢兴，2010)，但没食子酸却能够诱导活化斜纹夜蛾Spodopteralitura体内CarE和GSTs等多种解毒酶的活性，参与解毒代谢棉花次生代谢物(Rainetal.，2013)。本研究拟通过在美国白蛾人工饲料中添加没食子酸的方法，分析没食子酸对美国白蛾的营养效应及对解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响，以探究美国白蛾对寄主植物中广泛存在的该类次生代谢物的解毒代谢能力和生理响应模式。该研究结果将对揭示美国白蛾的寄主适应机制提供基础资料，为进一步完善美国白蛾防控体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 没食子酸人工饲料的配制及试虫的饲养

先用蒸馏水配制浓度为4%没食子酸溶液(CAS编号：149-91-7，AR，纯度：99.0%，国药集团)，70℃水浴加热使其充分溶解。参照曹利军等(2014)的方法配制美国白蛾人工饲料，按比例将一定体积的没食子酸溶液加入到人工饲料中搅拌均匀，分别配制成含没食子酸1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的美国白蛾人工饲料。没食子酸浓度梯度的设定参照李路莎等(2018)测定的8种寄主植物总酚含量(16.00～55.85 mg/g)以及相关文献中没食子酸人工饲料的浓度设置范围(王怡，2010;黄敏燕和李雪峰，2018)。

美国白蛾幼虫于室内用人工饲料(曹利军等，2014)饲养至4龄，选取生长状况一致的4龄幼虫作为供试虫源。饲养条件：温度25℃±1℃，相对湿度70%～80%，光周期12L ∶12D。

1.2 营养指标的测定

参照苏超等(2013)的方法，分别用1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的没食子酸人工饲料饲养美国白蛾幼虫。先将幼虫饥饿处理12 h以排空粪便，称取幼虫及人工饲料鲜重，用含没食子酸的人工饲料饲养美国白蛾幼虫48 h，再次称取幼虫及人工饲料的重量，继续饥饿处理12 h，烘干后称取幼虫(CGZ2)、虫粪(F)及饲料(YGZ2)重量。另外，饲养前称取人工饲料和饥饿处理的4龄幼虫鲜重，将与饲养用的饲料和试虫等重的饲料和试虫烘干至恒重，称重记作取食前人工饲料干重(YGZ1)和取食前幼虫干重(CGZ1)。以不添加没食子酸的人工饲料作为对照组(CK)。每个培养杯接入5头幼虫，试验重复3次。本试验共测定4个营养效应指标：近似消化率(approximate digestibility,AD)、食物利用率(efficiency of conversion of ingested food,ECI)、相对取食量(relative consumption,RCR)和相对生长率(relative growth rate,RGR)(浦名伟，2007)。计算公式为：AD(%)=(I-F)/I×100；ECD (%)=G/(I-F)×100；ECI (%)=G/I×100；RCR (g/g·d)=I/(B×T)；RGR (g/g·d)=G/(B×T)。式中，B：试验期间幼虫的平均体重；F：粪便干重；G：虫体增重量；I：幼虫的取食量；T为试验天数。G= CGZ2-CGZ1；B=(CGZ1+CGZ2)/2；I= YGZ1-YGZ2。

1.3 解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性测定

1.3.1酶提取液的制备

4龄幼虫饥饿处理12 h后，转移至含不同浓度没食子酸的人工饲料上饲养，每个培养杯接 5头幼虫作为1个重复，每个浓度梯度共设3个重复，即每个浓度共15头幼虫，分3个培养杯饲喂。将饲养后的幼虫放入冰冷生理盐水(0.86% NaCl)中清洗，除去杂质。虫体经滤纸拭干后称重，放入PE管。量取9倍体重的冷生理盐水，加入PE管。用研磨仪研磨虫体制成组织匀浆。4℃低温(12 000 r/min)离心10 min，取上清液作为酶提取液，以不添加没食子酸的人工饲料饲养的美国白蛾4龄幼虫的酶提取液作为对照。

1.3.2解毒酶及乙酰胆碱酯酶活性的测定

分别用1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的没食子酸人工饲料饲养美国白蛾幼虫24 h后，分别测定CarE、GSTs和P450 3种解毒酶和AchE的活性。同时，用浓度1.0%的没食子酸人工饲料饲养美国白蛾4龄幼虫不同时间(12，24，36，48 h，60 h)后，测定4种酶的活性，分析较低浓度的没食子酸对美国白蛾4龄幼虫解毒酶和AchE活性的影响。

总蛋白测定试剂盒(编号A045-3)、乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(编号A024)、羧酸酯酶测定试剂盒(编号A024)和谷胱甘肽S-转移酶测定试剂盒(编号A004)均购自南京建成生物，昆虫细胞色素P450测定试剂盒(编号JL22832)购自上海江莱生物有限公司。各种酶活性的测定步骤及计算方法具体参照试剂盒说明书。

1.4 数据处理

用Excel 2016统计及整理数据，采用SPSS 19.0 for Windows的one-way ANOVA分析检验4个营养效应指标(AD、ECI、RCR和RGR)、乙酰胆碱酯酶和解毒酶活性的均值及差异显著性(Tukey’s test,P<0.05)。用Origin 2018对不同浓度和不同处理时间的美国白蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶与解毒酶的活性进行作图。

2 结果与分析

2.1 没食子酸对美国白蛾的营养效应的影响

取食不同浓度没食子酸的人工饲料48 h后，各处理试虫的4项营养指标统计结果如表1。与对照组相比，不同浓度的没食子酸对美国白蛾幼虫的AD、ECI、RCR和RGR均产生显著影响(P<0.05)(表1)。ECI和RGR均不同程度的高于对照组。不同浓度没食子酸处理的美国白蛾幼虫的AD和RCR均低于对照组。

2.2 没食子酸对美国白蛾乙酰胆碱酯酶和解毒酶活性的影响

2.2.1不同浓度没食子酸对美国白蛾4龄幼虫乙酰胆碱酯酶和解毒酶活性的影响

用5个浓度梯度(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)的没食子酸人工饲料分别饲养美国白蛾4龄幼虫24 h后，AchE、CarE、GSTs和P450的活性如图1所示。结果表明，不同浓度的没食子酸对美国白蛾幼虫AchE、CarE、GSTs和P450的活性均有显著影响(P<0.05)。由图1A可见，1.0%没食子酸对美国白蛾幼虫AchE的活性具有一定抑制作用，但随着没食子酸浓度提高AchE的活性上升，随后又逐渐恢复到对照组的水平。浓度为1.0%～3.0%的没食子酸处理的美国白蛾幼虫CarE的活性均显著低于对照组(图1B)，表明没食子酸对美国白蛾幼虫CarE的活性具有显著抑制作用。较低浓度(1.0%～1.5%)的没食子酸对GSTs的活性有一定诱导作用，但随着没食子酸浓度提高，GSTs的活性却受到一定程度的抑制(图1C)。不同浓度的没食子酸处理的美国白蛾幼虫的P450活性始终高于对照组，且在没食子酸浓度为1.5%～2.0%时诱导作用最强，表明没食子酸在供试浓度范围内均能诱导美国白蛾幼虫P450的活性(图1D)。

表1 没食子酸人工饲料对美国白蛾4龄幼虫营养效应的影响Table 1 Nutritional efficiency of the 4th instar larvae of Hyphantria cunea feeding on gallic acid diets

注：表中数据为平均值±标准误，同一列数据后不同字母表示差异显著(Tukey氏检验,P<0.05)。Note:Data in the table are mean±SEand different letters following the data in a column show significant difference (Tukey’s test,P<0.05).

图1 取食不同浓度没食子酸饲料的美国白蛾4龄幼虫乙酰胆碱酯酶(A)和解毒酶(B-D)活性Fig.1 Activities of the acetylcholinesterase (A) and detoxification enzymes (B-D) of the 4th instar larvae of Hyphantria cunea feeding on different concentrations of gallic acid diets注：柱上不同小写字母代表不同浓度没食子酸处理的酶活性的差异显著性(Tukey氏检验，P<0.05)。Note:Different letters above bars show significant difference of enzyme activities with different concentrations of gallic acid treatment (Tukey’s test,P<0.05).

图2 1.0%没食子酸人工饲料处理不同时间的美国白蛾4龄幼虫的乙酰胆碱酯酶(A)和解毒酶(B-D)活性Fig.2 Activities of the acetylcholinesterase (A) and detoxification enzymes (B-D) of the 4th instar larvae of Hyphantria cunea treated by 1.0% gallic acid artificial diets for different time注：柱上不同小写字母代表1.0%没食子酸处理不同时间的酶活性的差异显著性(Tukey氏检验，P<0.05)。Note:Different letters above bars show significant difference of enzyme activities with different treatment time of 1.0% gallic acid (Tukey’s test,P<0.05).

2.2.21.0%没食子酸不同处理时间对美国白蛾4龄幼虫乙酰胆碱酯酶和解毒酶活性的影响

用含1.0%没食子酸的人工饲料饲养美国白蛾4龄幼虫，分别测定饲养12、24、36、48、60 h试虫的乙酰胆碱酯酶和解毒酶的活性，结果如图2所示。1.0%没食子酸处理不同时间的美国白蛾4龄幼虫的AchE、CarE、GSTs和P450的活性变化均差异显著(P<0.05)。在处理时间范围内，1.0%浓度没食子酸处理的美国白蛾幼虫的AchE和CarE的活性低于对照(图2A，图2B)，表明AchE和CarE的活性始终受到没食子酸的抑制，并且随着处理时间延长，没食子酸对两种酶的活性抑制作用逐渐增强。总体上1.0%没食子酸对美国白蛾GSTs的活性影响较小，24 h之内，处理组的GSTs的活性稍高于对照，但24 h之后与对照组的GSTs活性相当(图1C)。在处理时间范围内，没食子酸处理的美国白蛾幼虫的P450活性始终高于对照组(图1D)，表明1.0%没食子酸对P450的活性有持续稳定的诱导作用。可见，没食子酸对不同解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响不同，不同的解毒酶和乙酰胆碱酯酶对没食子酸的响应模式也不同。

3 结论与讨论

通过在美国白蛾人工饲料中添加不同浓度的没食子酸，研究没食子酸对美国白蛾幼虫营养效应指标和解毒代谢相关酶系的影响，以及不同酶类随着没食子酸浓度和作用时间变化的代谢响应模式。营养效应指标结果显示(表1)，没食子酸的存在导致美国白蛾幼虫的近似消化率和相对取食量降低，表明美国白蛾幼虫可能通过降低食物取食量和食物消化率以减少酚类次生代谢物质的毒害，而通过提高食物的利用率以满足其生长发育所需的营养，而且其相对生长量随着没食子酸浓度的增加有所提高，表明一定浓度没食子酸的短期作用(48 h)并没有影响其生长，反映美国白蛾幼虫对一定浓度没食子酸具有较强的生理适应能力。Hamamura等(1966)用含没食子酸的人工饲料饲喂家蚕Bombyxmori幼虫发现幼虫生长速度加快的现象。棉铃虫取食添加烟碱的人工饲料后相对取食量和近似消化率均显著下降，但食物利用率一定程度升高，生长率并没有出现下降(董钧峰等，2002)。苏超等(2013)研究不同植物对三条橙灯蛾Lemyraalikangensis生长发育的影响，结果表明天仙果饲喂的幼虫生长率与华东油柿饲喂的幼虫生长率相同，但消化率显著低于华东油柿饲喂组，而食物利用率显著高于华东油柿饲喂组。王桂花等(2016)研究3种植物对斜纹夜蛾的营养效应，结果表明3种植物间处理的斜纹夜蛾幼虫生长率差异不明显，但花生处理的幼虫取食量和消化率低于香蕉和芒果处理的幼虫，而食物利用率要高于其他两个植物处理的幼虫。昆虫取食植物量和对植物利用方面存在一定的补偿机制(朱俊洪等，2005)，昆虫通过内部的调节适应植物次生代谢物。美国白蛾幼虫提高食物利用效率可能是对取食量减少的一种补偿，以保证自身获得足够的能量。

植物次生代谢物可以诱导昆虫乙酰胆碱酯酶及解毒酶系的活性，提高昆虫的适应能力(Caietal.，2005;Hlavica，2011)。本研究结果表明，没食子酸在供试浓度和作用时间范围内能够持续稳定地诱导美国白蛾幼虫P450的活性，活化的P450在消化道和脂肪体等器官和组织内将次生代谢物降解为可溶或毒性更低的形式(Feyereisen，1999;Chungetal.，2006;Wangetal.，2014;Cuietal.，2016)，从而赋予美国白蛾幼虫对该类次生代谢物的抗性。没食子酸能显著抑制美国白蛾幼虫CarE的活性(图1B，图2B)。没食子酸浓度较低且处理时间较短时，能够一定程度诱导美国白蛾幼虫GSTs的活性(图2C)，但随着没食子酸浓度升高，GSTs的活性却受到一定程度抑制(图1C)。Zhou等(2016)认为低浓度的次生代谢物诱导GSTs的活性是昆虫的一种应急适应，高浓度次生代谢物产生的较强毒害作用会抑制酶活性。较低浓度的没食子酸(1.0%)随着处理时间的延长对AchE活性的抑制作用却加强(图2A)。上述结果表明，没食子酸对美国白蛾幼虫不同的解毒酶和乙酰胆碱酯酶具有不同的诱导或抑制作用，反映不同酶类在应对没食子酸的作用中具有不同的响应模式。王怡(2016)通过人工饲料添加没食子酸的方法研究次生代谢物没食子酸对玉米蚜Rhopalosiphummaidis解毒酶活性的影响，同样发现没食子酸对不同酶作用效果不同，没食子酸能够诱导玉米蚜CarE和P450的活性，但不影响AchE的活性。用1.0%没食子酸处理斜纹夜蛾，发现幼虫的AchE和GSTs活性均不同程度增加(黄敏燕和李雪峰，2018)。牟少飞等(2006)研究酚类物质槲皮素对B型烟粉虱Bemisiatabaci的CarE和GSTs活性影响时发现，低浓度槲皮素短时间处理诱导CarE和GSTs活性，但高浓度的次生代谢物会抑制酶活性的发挥。由此可见，植物次生代谢物对昆虫解毒酶等酶系活性的诱导是一个复杂的过程，不同酶之间相互协调完成对有毒次生代谢物的解毒代谢(朱香镇等，2018)。

本研究针对没食子酸对美国白蛾幼虫营养效应的影响和解毒酶等酶类的作用进行研究，发现美国白蛾幼虫可通过调节对食物的利用和诱导活化解毒酶的活性，增强对没食子酸的代谢能力，从而对含没食子酸的寄主植物产生适应性。植物次生代谢物的短期作用，会提高昆虫利用植物营养的效率和解毒酶类的活性。但有研究表明次生代谢物长期作用可能会对昆虫的生长发育、行为、繁殖等生命活动产生不利影响，甚至具有毒杀的效果(Delvasetal.，2011;王亚军等，2017)。因此，要全面认识美国白蛾幼虫对植物中没食子酸等次生代谢物化学防御的应对策略，还需持续观察没食子酸对美国白蛾完整发育周期的各项生理生化和生长发育指标的影响，甚至从基因水平探讨其分子调控机理，从而揭示美国白蛾对寄主植物的适应机制。