不同方法对红火蚁社会型鉴定效果的比较

王晨轩，贾羚艺，李天楚，陈 立，黄大卫,,4*

(1.河北大学生命科学学院，河北省动物系统学与应用重点实验室，河北保定 071002；2.中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室，北京 100101；3.中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室，北京 100101；4.南开大学生命科学学院，天津 300350)

红火蚁SolenopsisinvictaBuren，膜翅目蚁科，是一种社会性昆虫，有多个品级，包括蚁后、有生殖能力的雌蚁、雄蚁，以及无生殖能力的工蚁。红火蚁原产于南美洲，后传入美国、澳大利亚、新西兰，乃至亚洲的诸多国家和地区，例如中国大陆、台湾、香港、澳门、菲律宾、泰国、马来西亚等(董慧和杨定，2005)。该物种扩散能力极强，具有很强的攻击性，是世界上最成功的入侵性蚂蚁之一(Tschinkel，2006)，可在农业和林业的生产、生态平衡，以及公共安全等方面产生巨大危害(Vinson，2013)。

红火蚁具有单蚁后(Monogyne)和多蚁后(Polygyne)两种社会型，单蚁后型巢穴仅具有一只可繁殖蚁后，多蚁后型巢穴中具有两只及以上可繁殖蚁后。红火蚁自2004年在中国大陆被发现后，疫情严重，传播广泛(陆永跃和曾玲，2015)。在红火蚁传播过程中，其社会型格局可在同一地区的不同时间发生动态变化，不同地区间社会型格局也不相同。不同社会型的红火蚁在行为、种群结构、扩张速度等方面存在较大差异，因此鉴定社会型是对红火蚁制定有效监控方案的关键步骤(邵敬国等，2008)。

关于红火蚁两种社会型产生的机制已有较为深入的研究，红火蚁已日渐成为研究蚂蚁类群社会结构的模式物种。Gp-9基因对红火蚁巢穴中工蚁是否接纳蚁后有着很大影响(Ross，1997)。单蚁后在该基因位点是纯合子，仅拥有Gp-9B等位基因，而多蚁后型是杂合子，拥有Gp-9B和Gp-9b两个等位基因。不同社会型由Gp-9基因的等位基因决定，b等位基因与红火蚁多蚁后社会型有密切关系(Ross，1998)。对Gp-9进行测序后，发现该基因编码了一种信息素结合蛋白，该蛋白与工蚁能否接受纯合子蚁后或杂合子蚁后相关(Ross，2002)。

单蚁后巢穴中，基因型为BB的雌蚁与基因型为BB的雄蚁婚飞交配后，产生后代均为BB型。单蚁后巢穴产生的BB型雌蚁个体较大，婚飞后能够独立建立新巢，并培育第一代工蚁。多蚁后巢穴中的Bb型蚁后会产生BB、Bb和bb 3种基因型后代，其中bb型工蚁或蚁后寿命很短；BB型雌蚁体型比单蚁后巢穴中的BB型雌蚁小，短距离婚飞后无法独自建立新巢，最终回归旧巢或加入其它多蚁后巢穴，但会逐渐被Bb型工蚁杀死(DeHeer，1999；Huang and Wang，2014)，而Bb型蚁后倾向回归旧巢进行繁殖(Krieger，2005)，最终导致Bb基因型占多蚁后型巢穴基因型的90%左右，因此多蚁后型巢显示杂合子基因型(Ross，1997)。

单蚁后种群与多蚁后种群除蚁后数目和身体大小不同之外，还有诸多特征表现出明显差异。多蚁后型蚁巢较小且蚁群密度大，繁殖能力强(Rossetal.，1999)，具有更强的种间竞争力(Porteretal.，1988)，因此多蚁后型能够更好的适应入侵环境，建立新的生态平衡(Porter and Savignano，1990)。高密度多蚁后型巢穴增加了防治频次和成本(Greenbergetal.，1992)。虽然已经有鉴定红火蚁种群的社会型方法报道，但缺乏一套可重复性高且操作便捷的标准化鉴定方法。

红火蚁的巢穴密度、外形及行为等特征可以初步判断红火蚁的社会型。多蚁后型红火蚁与单蚁后型红火蚁相比，工蚁体型较小，数量较多。多蚁后型红火蚁巢穴之间相邻较近，蚁巢密度较大。当多蚁后型的工蚁遭遇同种个体的入侵时，无论入侵者来自单蚁后型巢穴，还是来自于多蚁后型巢穴，都没有很强的攻击性，而单蚁后型的工蚁与之相反，对同种个体入侵的防范意识更强(Fritz and Meer，2003)。依据这些生物学特征，可以简单的对红火蚁的类型进行区分，但是生物学观察法容易出现因观察不详细或小样本量对统计造成的误差产生判断错误。利用PCR(Polymerase Chain Reaction)等分子生物学手段，能够达到更好的鉴定效果。Gp-9基因位于红火蚁基因组的低重组区域，通过对红火蚁15种Gp-9基因的比较，发现该基因在红火蚁类群中十分保守，编码区在不同物种间仅涉及点突变的变异(Krieger and Ross，2005)。因此可以通过对该基因及附近区段的DNA序列设计特异引物，利用PCR扩增和凝胶电泳等手段验证红火蚁DNA样品中是否含有Gp-9等位基因B或b，进而判断红火蚁种群的社会型。

基于PCR的鉴定方法，已有大量研究报道了不同的引物或方法对红火蚁社会型的鉴定效果，受到了国内外学者的青睐(Chenetal.，2006;Goodismanetal.，2007;Laietal.，2008;Yangetal.，2008;Yangetal.，2009;Allenetal.，2010;Garlapatietal.，2010;Laietal.，2010;Linetal.，2010;Chirinoetal.，2012;Laietal.，2012;Yangetal.，2012;Chenetal.，2014;Kelly and Sellers，2014;Laietal.，2015;Kayetal.，2018)。目前已有多种针对Gp-9序列设计的引物，可以通过PCR对红火蚁的Gp-9基因型进行鉴定。本文以中国红火蚁为材料，选取7对不同的特异引物进行PCR扩增，并对比不同种类的DNA聚合酶在实验中的扩增效果，从而比较实验结果的准确性和重复度，筛选出了一套便捷可靠的实验方案，为鉴定红火蚁社会型提供了技术参考，以期为红火蚁的相关研究提供帮助。

1 材料和方法

1.1 样本采集及生物学指标的测量

实验所用红火蚁于2018年7月和9月采集于广东省广州市华南农业大学校园和广州市黄埔区广州科学城。观察蚁巢大小及密度后掘土采集蚂蚁，待蚁群稳定后使用“滴水浸泡法”将蚁群从土壤中逼出，转移至饲养盒中，饲养盒为60 cm×44 cm×36 cm的塑料整理箱，整理箱四壁涂有Fluon以防止蚁群逃逸，温度26℃，湿度60%～70%并提供水、蜂蜜水和黄粉虫在实验室饲养。对各巢蚂蚁进行生物学观察，统计每巢中脱翅蚁后的数量。

1.2 基因组DNA提取

本实验共采用来自华南农业大学校园和广州科学城不同区域的8巢红火蚁，每巢分别随机收集25头工蚁，使用EasyPure Genomic DNA Kit (TransGen Biotech,Beijing,China)提取基因组DNA，使用NanoDrop-2000 Spectrophotometer (Thermo,Madison,WI,USA)测量DNA浓度和纯度。最终保证使用的DNA浓度大于100 μg/μL，OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8～2.0。

1.3 PCR扩增反应

由于不同引物所扩增的片段长度不同、引物的退火温度不同，所以本研究中针对不同的引物，采取不同的PCR程序(表1)。此外，为对比不同DNA聚合酶的扩增效果，对编号为7和8的红火蚁样品，针对相同的引物(多重PCR技术的引物，表1)使用不同的DNA聚合酶进行扩增。共选取4种DNA聚合酶(表2)：(1)两种不同厂家的热启动高保真酶：Platinum® Taq DNA polymerase (Invitrogen,Carlsbad,USA)，TransStart® Taq DNA Polymerase (TransGen Biotech,Beijing,China)。(2)两种不同厂家的高保真酶：TransTaq® DNA Polymerase High Fidelity (TransGen Biotech,Beijing,China)，KOD DNA Polymerase (Toyobo,Osaka,Japan)。

1.4 凝胶电泳检测及限制性内切酶检测

PCR产物使用1%凝胶电泳检测后，选择单蚁后型和多蚁后型PCR产物使用限制性内切酶HindIII (NEB,Beijing,China)，按照使用说明进行酶切，检测条带大小。

2 结果与分析

2.1 红火蚁的生物学观察

通过一定时间的观察，发现8号红火蚁巢中工蚁体型较大，且仅发现一个脱翅蚁后。编号1-7巢中可发现两个及以上脱翅蚁后，编号1-7较编号8巢中工蚁体型小。因此通过形态特征鉴定推测蚁巢8中的红火蚁为单蚁后型，其他7巢为多蚁后型。

2.2 不同引物扩增红火蚁 Gp-9 基因的结果

以红火蚁DNA为模板，用7对特异引物进行扩增，经凝胶电泳检测(图1)可见多重PCR技术(图1A)条带清晰，单蚁后型与多蚁后型结果区别明显，重复性较高(成功率0.86，n=7)。对其PCR产物进行酶切之后(图1B)，多蚁后型显示两条大小不一的条带，单蚁后型带型不发生改变。针对b等位基因的一种方法(图1C，D)可在多蚁后型样品中扩增出单一条带(分别为219 bp 和259 bp)，单蚁后型无条带，重复性较高(成功率1.00，n=7)。对2013年报道的4对同时扩增B、b等位基因的引物(Wangetal.，2013)进行实验(图1E-H)，发现4对引物的成功率均较低，或扩增条带不清晰，容易出现杂带，对实验判断造成影响。其中图1G对应的引物，虽然可获得清晰条带，但是重复性较低(成功率0.43，n=7)。

表1 引物及其程序设定Table 1 Primers and PCR program settings

表2 DNA聚合酶Table 2 DNA polymerases

图1 应用 Gp-9等位基因检测红火蚁的社会型Fig.1 Gp-9 banding patterns of social forms of Solenopsis invicta注：实验中各引物PCR扩增结果及条带大小见电泳图；M，DNA Marker；1,2,3,4,5,6,7,8蚁巢编号；A，多重PCR技术；B，对 Gp-9B-specific 26BS 16BAS，Gp-9b-specific:24bS 25bAS引物PCR扩增产物的酶切鉴定；C，D，Gp-9b 等位基因扩增法；E-H，其他同时扩增B、b等位基因的引物；所使用的DNA聚合酶均为Invitrogen公司生产的热启动酶Platinum® Taq DNA polymerase。Note:PCR amplification of each pair of primer in the experiment and their sizes were shown in electrophoresis.M,DNA Marker;1,2,3,4,5,6,7,8 Nest numbers;A,Multiplex PCR,B,Enzyme digestion of PCR amplification products of Gp-9B-specific 26BS 16BAS and Gp-9b-specific 24bS 25bAS primers;C,D,Gp-9b allele amplification;E-H,other primers that simultaneous amplification of B and b alleles;All the PCR were conducted using Platinum® Taq DNA polymerase,Invitrogen.

2.3 不同DNA聚合酶扩增红火蚁 Gp-9基因的结果

以两巢红火蚁的DNA为模板，使用相同引物(多重PCR技术的引物Gp-9B-specific:26BS 16BAS，Gp-9b-specific:24bS 25bAS)，在相同的PCR反应体系和扩增程序(表1)下，分别用4种不同的DNA聚合酶(表2)进行扩增，以对比不同DNA聚合酶在验证红火蚁社会型PCR实验中的效果。经凝胶电泳检测发现4种酶的扩增效果具有明显差别：高保真酶TransTaq® DNA Polymerase High Fidelity扩增产物无可检出的电泳条带(图2A)；热启动酶Platinum® Taq DNA polymerase扩增效果明显优于其他酶，基本没有引物二聚体产生，电泳带型易于区分单蚁后多蚁后，单蚁后型为单一条带，多蚁后型为两条条带(图2B)；热启动酶TransStart® Taq DNA Polymerase扩增产物中有非特异扩增的杂带(图2C)；KOD DNA Polymerase酶扩增产物的电泳条带较亮，说明产物的DNA量较高，此外条带较宽，无法区分相邻带型，且条带大小与预期不符，说明有大量非特异扩增(图2D)。由此可见，所对比的4种DNA聚合酶中，热启动酶Platinum® Taq DNA polymerase最为适用。

图2 利用多重PCR技术引物和使用不同DNA聚合酶对两种社会型红火蚁的扩增结果Fig.2 Identification of two different social forms of Solenopsis invicta Buren by Multiplex PCR using different DNA polymerases.注：M，DNA Marker；7和8，蚁巢编号，分别为多蚁后型和单蚁后型；图A，用酶TransTaq® DNA Polymerase High Fidelity扩增结果；图B，用酶Platinum® Taq DNA polymerase扩增结果；图C，用酶TransStart® Taq DNA Polymerase扩增结果；图D，用酶KOD DNA Polymerase扩增结果。Note:M,DNA Marker;7 and 8,nest Numbers,polygyne and monogyne respectively;A,results of PCR using TransTaq DNA Polymerase High Fidelity;B,results of PCR using Platinum® Taq DNA polymerase;C,results of PCR using TransStart Taq DNA Polymerase;D,results of PCR using KOD DNA Polymerase.

3 结论与讨论

自红火蚁社会型分化的调控机制报道以来，针对Gp-9位点的PCR分子鉴定手段有很多。本研究基于这一背景进行了各种方法之间的比较，选取了7对具有代表性的引物以及4种DNA聚合酶进行对比，并最终获得了实验室内鉴定红火蚁社会型的最佳实验方案。

通过比较7对引物的实验可行性及重复性，本研究发现其中4对同时扩增B、b等位基因的引物因重复性较差或扩增条带特异性不高(图1E-H)，不利于红火蚁社会型的实验鉴定。而多重PCR技术与Gp-9b等位基因扩增(图1A-D)的准确率较高，重复性较强。在多重PCR技术最早的报道中，Valles and Porter (2003)提出可以将PCR产物进行限制性酶切，从而更易辨别单蚁后型和多蚁后型的条带。在本研究的实验中，发现该方法的PCR步骤可同时扩增出大小不一的条带，分别对应多蚁后型和多蚁后型。其PCR产物经电泳后已经可以清晰的展现不同条带大小的区别(图1A)，无需后续的酶切步骤(图1B)即可用于判断样品的社会型。而Gp-9b等位基因扩增的两种引物(图1C，D)只能扩增出b等位基因的单一条带，对B等位基因无扩增效力，是针对b等位基因的特异引物。因此可以将Gp-9b等位基因扩增与多重PCR技术搭配使用，二者的电泳结果可相互印证，共同判别红火蚁的社会型。

在对不同酶的对比中，本研究所选的4种聚合酶均具有不同强度的保真性，并且这4种酶中还包括两种热启动酶。酶的高保真性主要可以通过两种手段实现，一种是利用某些特殊的DNA聚合酶本身的保真性，另一种是将普通DNA聚合酶与具有外切酶活性的其他酶按不同比例混合。因此不同品牌的不同高保真DNA聚合酶产品，其保真效率也不尽相同。在本研究所对比的4种DNA聚合酶中，四者均具有高保真功能。其中高保真酶TransTaq®DNA Polymerase High Fidelity同时具有5′ → 3′的外切酶活性和3′ → 5′的外切酶活性，保真效果最好，错配率最低，用该酶进行红火蚁社会型的PCR鉴定，没有扩增出预期条带。引物序列与待测样品的序列结合并非完全一致，不能满足此类高保真DNA聚合酶的扩增条件。另外，KOD DNA Polymerase酶使用了自然菌株(超嗜热原始菌ThermococcuskodakaraensisKOD1株)的DNA聚合酶，该酶具有天然的3′ → 5′的外切酶活性，但活性较其他混合高保真酶类更弱，因此非特异扩增产物较多，不适用于红火蚁的社会型鉴定。

而热启动DNA聚合酶的工作原理主要是通过对酶进行化学修饰、加入酶抗体或其他特异蛋白等手段，减少低温下DNA聚合酶发生链错配或产生引物二聚体。本研究所对比的4种DNA聚合酶中，有两种具有热启动功能，其中热启动酶Platinum®Taq DNA polymerase扩增效果优于热启动酶TransStart®Taq DNA Polymerase，其原因可能来自各个方面，例如保真酶的成分和比例、热启动的原理不同等等。而与其他3种酶比较，Platinum®Taq DNA polymerase的效果也为最佳，这可能与其适中的保真性和较强的热启动功能有关，该酶在对红火蚁社会型的PCR鉴定中较为适用。

针对本研究所采集的8个蚁巢，生物学形态鉴定结果中仅编号8巢有单只脱翅蚁后，Gp-9b等位基因扩增和多重PCR技术所获得的鉴定结果与生物学观察所得结果相互验证，弥补了生物学观察所带来的缺陷，最终表明1-7号巢为多蚁后型巢穴，而只有8号巢穴为单蚁后型。这表明Gp-9b等位基因扩增和多重PCR技术的分子鉴定结果十分可靠，且重复率高，可以与生物学观察一同用于判定红火蚁的社会型。

除了本研究所采用的基于PCR的分子鉴定法外，红火蚁的社会型的判断还有其他方法，例如蛋白质电泳法、探针法等。蛋白质电泳法(DeHeer，1999)利用Gp-9B蛋白与Gp-9b蛋白的迁移速率不同这一原理，根据蛋白电泳条带判断Gp-9的基因型，从而判断红火蚁的社会型。但是蛋白质电泳对提取样品有较高的要求，必须采集活体蚂蚁且每个样本所需蚂蚁数目较大，加之蛋白质电泳技术本身的复杂性和不稳定性，因此此方法并不适于快速鉴定红火蚁社会型。探针法利用与Gp-9基因结合的引物和探针检测Gp-9基因型(Ascunceetal.，2010)，有较高的灵敏度，但该方法所需探针较为昂贵，且实验流程繁琐，需配备荧光定量PCR仪，不适合在所有实验室普及。

此外还有多种PCR与其他实验手段相结合的方法，例如RFLP法(Restriction Fragment Length Polymorphism) (Lucasetal.，2015)，该方法需设计多对引物进行巢式PCR，且扩增片段较长(2 kb)，增加了实验的难度，此外RFLP操作繁琐,不适于快速检测红火蚁社会型。而HRM(高分辨率熔解曲线)法需要借助实时荧光定量PCR完成实验(Oakeyetal.，2011)，实验操作过于复杂。此外还有人提出可以利用红火蚁cDNA扩增Gp-9序列，但该方法需要进行红火蚁RNA的提取和cDNA的逆转录(Leal and Ishida，2008)，增加实验步骤。

由此可见，上述不同方法因为实验步骤繁琐、成本较高，或需要特殊的实验仪器等原因并不适用于所有实验室。与其对比之下，本研究筛选出的多重PCR技术与Gp-9b等位基因扩增相结合的PCR鉴定方案对蚂蚁样品的要求较低，只需使用酒精浸泡的工蚁样本，就可通过简单的DNA提取步骤获得实验所需DNA样品。此外，基于PCR的技术简单易行，具备常规分子生物学器材配备的实验室均能操作，实验耗时短，通常可在2～3 h内批量完成多个不同巢穴的鉴定试验，更适用于普通实验室对红火蚁社会型的鉴定。

综上所述，本文提出一套针对红火蚁社会型鉴定的组合方案——将多重PCR技术，Gp-9b等位基因扩增这两种分子生物学方法相结合，利用具有中等保真性能和较强热启动效率的DNA聚合酶进行PCR扩增，并辅以生物学观察的手段进行鉴定，通过这三者实验结果的相互验证，能更好的判断中国红火蚁种群的社会型。