丁苯酞通过NLRP3炎性小体信号通路对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞焦亡的影响

张 玮，马静萍

近年来，脑血管疾病发病率越来越高，急性脑梗死仍是脑血管病发病和死亡的主要原因，快速诊断和再灌注可以提高脑梗死存活率，然而，脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，I/R)会引发明显的无菌性炎症反应，从而影响预后。脑缺血再灌注损伤是指各种原因引起脑缺血缺氧致脑组织坏死前，闭塞的脑血管再通恢复血流后脑组织损伤进一步加重的现象[1-2]。脑血流量的恢复可致活性氧(ROS)积累、细胞离子稳态失调等进一步损害缺血组织，从而引起无菌性炎症反应[3]。最近，在缺血性脑卒中病人中发现了一种由炎性小体介导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)激活导致程序性细胞死亡的促炎形式，称为细胞焦亡[4]。一些研究强调，NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体可能对介导炎症反应、诱导细胞损伤和卒中后死亡至关重要[5-7]。多年以来，国内外学者都证实了丁苯酞可通过各种机制减轻缺血引起的脑损伤，包括增加半暗带区脑血流量、抗血小板聚集、抑制血栓形成、抗炎、抗氧化等。而丁苯酞通过NLRP3炎性小体信号通路对脑缺血再灌注的影响报道较少。本研究旨在将不同剂量的丁苯酞作用于大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，通过行神经功能缺损评分、测定脑梗死体积以及苏木素-伊红(HE)染色、免疫组化法检测细胞焦亡相关蛋白caspase-1、NLRP3、白细胞介素-1(IL-1)的表达来探究丁苯酞的神经保护机制，为药物的临床应用以及后续药物研发提供新的思路及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，体质量250～300 g，由山西医科大学动物实验中心提供，随机分笼，大鼠被安置在适宜温度[(22±3)℃]和湿度[(60±5)%]的房间，按照大鼠标准饲养方式喂养，垫料及鼠粮由山西医科大学动物实验中心提供，大鼠自由进食及取水。

1.1.2 实验试剂及器材 丁苯酞软胶囊来自石药集团恩必普药业有限公司，caspase-1、NLRP3、IL-1、兔IgG即用型SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Tween80溶液用于溶解丁苯酞软胶囊，磷酸缓冲盐溶液(PBS)、3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)显色剂、苏木素、伊红等均由山西医科大学第一医院病理科提供，0.26 mm鱼线购自浙江连球工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 参照Longa等[8]的线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌注模型，将50只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组，分别为假手术组、丁苯酞低剂量治疗组、丁苯酞中剂量治疗组、丁苯酞高剂量治疗组以及模型组，每组10只，各组大鼠均于术前禁食12 h。称体重后使用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 mL/kg)，在颈部作正中切口暴露出左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，在CCA处剪一小口，将鱼线从颈总动脉插入颈内动脉，感阻力较大时停止继续送入，即阻断血液流向大脑中动脉。假手术组仅分离血管，治疗组与模型组采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型。

1.2.2 给药方法 将0.1 g丁苯酞软胶囊溶解于0.5%Tween80溶液中，分别配制成5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的丁苯酞混悬液，治疗组于缺血1 h后，分别腹腔注射不同浓度的丁苯酞混悬液4 mL/kg，模型组及假手术组同时注射4 mL/kg的Tween80溶液，于给药1 h后(缺血2 h)拔出鱼线实现缺血再灌注。

1.3 观察指标

1.3.1 Longa神经功能缺损评分 假手术组在术后26 h行Longa评分，丁苯酞不同剂量治疗组及模型组在缺血再灌注24 h后行Longa评分。0分：无明显神经功能缺损症状；1分：爬行时不能伸展右侧肢体；2分：爬行时向右侧旋转；3分：爬行时向右侧倾倒；4分：大鼠昏迷，不能行走。其中评分1～3分大鼠纳入实验，0分及4分大鼠剔除，同时给予相应数量的补充。

1.3.2 脑梗死体积 每组随机选取5只评分符合标准的大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉，迅速断头取脑，取出后去除嗅球、额极、小脑及低位脑干后放入生理盐水中浸泡，并置入-20 ℃冰箱中冷冻30 min，取出后以2 mm为间隔行冠状切片，共切5片，并置于现配的2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyhetrazolium chloride，TTC)溶液中放入37 ℃避光孵箱中静置30 min，10%甲醛溶液浸泡24 h后取出。正常组织TTC染色为红色，梗死处TTC染色为白色。染色完成后进行拍照，用图像分析软件Image Pro-Plus 6.0计算各脑片梗死面积，并乘以厚度，得出各大鼠的脑梗死体积，并计算得出脑梗死体积百分比。

1.3.3 HE染色观察细胞学形态及免疫组化测定大鼠脑组织中caspase-1、NLRP3、IL-1蛋白表达 将每组余下的5只大鼠腹腔深度麻醉后暴露腹腔及胸腔，剪开右心耳，用9号输液器针头扎入左心室并迅速注入150～200 mL生理盐水，直至观察到肝脏呈苍白透明状及右心耳流出液体为无色透明，即刻注入200 mL 4%多聚甲醛溶液进行内固定，至大鼠躯体及肢体僵硬。快速断头取脑，洗净表面血渍后浸泡于10%甲醛溶液中4 ℃外固定24 h。取视交叉前后2 mm脑组织行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。包埋后行连续冠状切片，切片厚度约2 μm再烤干，按规定于二甲苯溶液及不同浓度酒精中脱蜡后分别进行HE染色及免疫组化测定。HE染色使用全自动HE染色机，封片后于400倍光学显微镜下观察。测定海马组织中caspase-1、NLRP3、IL-1的表达，免疫组化试剂依照说明书调配至合适浓度，步骤如下：抗原修复→5%BSA封闭液封闭→滴加一抗→滴加二抗→显色→核复染→封片，将玻片置于400倍普通光学显微镜下，细胞核呈棕黄色或有棕黄色颗粒沉积为阳性细胞。于大鼠左侧缺血组织处选取5个400倍镜下非重叠视野，计数阳性细胞数。

2 结 果

2.1 实验模型评估 目前Longa线栓法是制造大鼠脑缺血再灌注损伤模型最常见方法之一，但由于实践经验不足，致一部分大鼠造模失败。其中1只死于过度麻醉，2只未出现神经功能缺损症状，均给予相应数量大鼠补充。

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分比较 假手术组大鼠神经功能基本正常，Longa评分为0分，其余4组均不同程度出现神经功能缺损症状，表现为右侧肢体不能伸展、行走向右侧旋转、行走向右侧倾倒等。与模型组相比，丁苯酞低剂量治疗组、中剂量治疗组与高剂量治疗组大鼠的神经功能均改善(P<0.05)，且丁苯酞中、高剂量治疗组大鼠神经功能的改善优于低剂量治疗组(P<0.05)，中、高剂量治疗组间神经功能改善差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较(±s) 单位：分

与模型组比较，①P<0.05；与丁苯酞低剂量治疗组比较，②P<0.05。

2.3 各组大鼠脑梗死体积比较 与模型组比较，丁苯酞低、中、高剂量治疗组脑梗死体积明显缩小(P<0.05)，且中、高剂量治疗组缩小更明显(P<0.05)，中、高剂量治疗组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑梗死体积比较(±s) 单位：%

与模型组比较，①P<0.05；与丁苯酞低剂量治疗组比较，②P<0.05。

2.4 各组大鼠细胞学形态比较 假手术组大鼠神经元排列整齐紧密，细胞大小正常，神经结构清晰，细胞膜完整，核膜清晰，胞质均质染色；模型组梗死区域出现大量坏死神经元，神经元细胞减少，结构破坏，细胞膜破裂，核膜消失，胞质染色变浅等；丁苯酞治疗组均出现上述表现，但较模型组程度轻，且中、高剂量治疗组较低剂量治疗组程度更轻。

2.5 各组大鼠脑组织中caspase-1、NLRP3、IL-1蛋白表达水平比较 连续400倍视野观察25个图片取平均值来计算焦亡的阳性细胞数。caspase-1蛋白在假手术组表达最少，在模型组表达最多，丁苯酞低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组表达高于假手术组(P<0.05)，低于模型组(P<0.05)，丁苯酞中、高剂量治疗组表达低于丁苯酞低剂量治疗组(P<0.05)，丁苯酞中、高剂量治疗组间蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。NLRP3蛋白在假手术组表达最少，在模型组表达最多，丁苯酞低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组蛋白表达高于假手术组(P<0.05)，低于模型组(P<0.05)，丁苯酞中、高剂量治疗组蛋白表达低于丁苯酞低剂量治疗组(P<0.05)，丁苯酞中、高剂量治疗组间蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。IL-1蛋白表达，与假手术组相比，模型组阳性细胞数明显增多；与模型组相比，丁苯酞治疗组阳性细胞数明显减少(P<0.05)，而丁苯酞中剂量治疗组、高剂量治疗组表达低于丁苯酞低剂量治疗组(P<0.05)，丁苯酞中、高剂量治疗组间蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

组别只数caspase-1阳性细胞数NLRP3阳性细胞数IL-1阳性细胞数假手术组50.88±0.832.56±1.042.72±0.84丁苯酞低剂量治疗组56.04±1.02①②10.84±1.07①②8.04±0.68①②丁苯酞中剂量治疗组54.24±0.83①②③7.20±0.76①②③4.76±0.60①②③丁苯酞高剂量治疗组53.84±0.80①②③7.04±0.74①②③4.44±0.51①②③模型组510.16±1.43 14.96±1.2112.48±0.87

与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05；与丁苯酞低剂量治疗组比较，③P<0.05。

3 讨 论

随着近年来对缺血性脑卒中动静脉溶栓及血管内介入治疗的开展，早期积极进行血管再通、挽救缺血半暗带备受关注，而缺血再灌注也受到越来越多的重视，缺血再灌注损伤是一个极为复杂的病理生理过程，其特征是受损脑组织区域细胞因子、趋化因子和炎症因子增多。现已有研究证实，在脑缺血再灌注损伤过程中，过量的氧化应激可诱导细胞凋亡、坏死、自噬和炎症反应，是脑缺血再灌注损伤的机制[9]。当发生脑缺血再灌注损伤时，激活的损伤信号通路通过降低损伤和显著抑制白细胞或炎症介质来促进细胞存活，以减少缺血再灌注损伤[10]。因此，炎症在脑缺血再灌注损伤的病理生理学中起着至关重要的作用。NLRP3炎性小体作为炎症反应的介质，与许多非生物危险信号有关，包括葡萄糖、活性氧(ROS)等，这些非生物危险信号可诱导非细菌性炎症反应[11-13]。

NLRP3由3个不同的结构域组成：N-端caspase酶激活和募集结构域(CARD)或PYD效应结构域、中央核苷酸结合和寡聚化结构域(NACHT)、C-端亮氨酸重复区(LRRs)[14-15]。NLRP3在受到来自外界或是细胞内的危险信号后，NLRP3的LRR与其配体结合后使无活性状态的NLRP3产生构想变化，显露出NACHT结构域，通过腺苷三磷酸(ATP)聚合形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚体，NLRP3通过氨基端的PYD与衔接蛋白(ASC)的PYD结合，同时ASC的CARD和caspase-1的CARD结合，以此形成NLRP3炎性小体从而激活caspase-1。Caspase-1介导白细胞介素-1β(IL-1β)前体裂解成具有活性的IL-1β，IL-1β能募集、激活其他免疫细胞，诱导趋化因子、炎症因子等的合成，放大炎症反应，如同发生级联效应，最终引起细胞焦亡[16-17]。与其他细胞死亡方法相比，细胞焦亡具有独有的特征，包括caspase-1的激活、膜孔的形成和细胞内容物的渗漏[18-19]。细胞焦亡可导致炎症细胞因子释放，与凋亡(包括DNA碎裂和核浓缩、形成凋亡小体)和坏死(如质膜完整性丧失和细胞内物质释放)[20]有共同的特点。丁苯酞作为我国自主研发的药物，能够促使缺血性脑卒中后侧支血管的形成，从而改善脑组织能量代谢、清除自由基、抑制脑组织神经元凋亡和保护神经等[21]。

本研究证实了NLRP3炎性小体活化诱导的细胞焦亡途径在大鼠脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用，包括caspase-1、NLRP3、IL-1β表达增加，细胞质肿胀，炎症因子释放，加剧了脑缺血再灌注损伤。同时本研究结果还表明，不同剂量丁苯酞可通过NLRP3炎性小体信号通路抑制细胞焦亡，改善脑缺血再灌注损伤，且治疗效果呈剂量依赖趋势，即丁苯酞中、高剂量治疗组梗死体积、神经功能缺损评分、组织形态学、焦亡阳性细胞数方面都优于低剂量治疗组。提示NLRP3炎性小体激活及其诱导的caspase-1依赖性细胞焦亡是脑缺血再灌注损伤的新机制，其信号通路可为治疗缺血性脑卒中提供新的治疗靶点。然而，本研究仍有一些不足之处，还需进一步研究特异性炎症抑制剂和NLRP3基因敲除或沉默在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用，以验证NLRP3炎症小体的特异性作用；再进一步研究NLRP3炎症小体诱导的脑缺血再灌注损伤的上游信号通路也是下一步研究方向。