c-Jun抑制剂对大鼠心肌纤维化抑制作用

鲍宏刚，赵冰，徐志勇，薛丽

心房颤动（房颤，AF）是临床上最常见的心律失常，随着世界人口老龄化趋势的增加，AF的发病率也有逐年增加的趋势，因此对于AF发病机制的研究一直是医学研究的热点。而心房纤维化是AF时心房重构的重要表现形式，在AF发生和维持中的起到重要作用[1,2]。研究指出AF时血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量的升高可参与心房纤维化的形成[3,4]，AngⅡ可通过与其Ⅰ型受体相结合，激活丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKS）中的c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路，诱导产生多种生物细胞学效应如：炎症、凋亡、生长及分化等[5-7]，该通路的激活可能参与心房纤维化[8,9]的形成。因此我们推测抑制JNK信号转导通路的激活，可能起到改善心房纤维化的作用。故本研究参考Zhang等[10]方法采用皮下多点注射大剂量盐酸异丙基肾上腺素（ISO）诱导产生大鼠心房纤维化模型，观察JNK信号转导通路抑制剂SP600125对大鼠心房纤维化的影响。

1 资料和方法

1.1 实验动物SPF级雄性Waster大鼠32只，体质量为（180±20）g。购自第四军医大学实验动物中心（动物使用许可证号：2007000524909）。

随机数字表法等分为4组：对照组、二甲基亚砜（DMSO）组、盐酸异丙肾上腺素（ISO）[5mg/（kg·d）]组（模型组）、ISO[5 mg/（kg·d）]+SP600125[10 mg/（kg·d）]组（抑制剂组）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立参考Zhang等[10]方法采用皮下多点注射大剂量盐酸异丙基肾上腺素（ISO）诱导产生大鼠心房纤维化模型，模型组和抑制剂组大鼠按5 mg/kg体质量腹部皮下多点注射ISO（购自上海禾丰制药有限公司），抑制剂组参照金鑫等[11]方法于ISO注射前1 h按10 mg/kg体质量给予SP600125溶液（SP600125溶于DMSO液中配成浓度为4 mg/ml的溶液）尾静脉注射（SP600125及DMSO溶液均购自美国sigma公司），1/d，连续7 d。而对照组、DMSO组给予等量生理盐水多点腹部皮下注射，而DMSO组尾静脉注射与抑制剂组等剂量的DMSO，以上各组处理，1/d，连续7 d。各组大鼠于7 d后脱臼处死。

1.2.2 取材及标本处理各组大鼠脱臼处死后立即开胸、取出心脏，沿心脏长轴用眼科剪剪开大鼠心脏，取心房组织置于10%中性甲醛缓冲液中固定24 h后，石蜡包埋，连续切片4张,切片厚度4 μm， 分别用于H-E染色、Masson染色、p-JNK1/2/3、p-c-Jun免疫组化染色。剩余心房组织取出后立即置-80℃冰箱中冷冻保存，用于放免法检测AngⅡ的含量。

1.2.3 AngⅡ含量的测定取出100 mg冻存的心房肌组织，低温研磨并按放射免疫试剂盒（购自北京北方生物技术研究所）说明书要求剂量加入两种酶抑制剂（二巯基丙醇、8-羟基喹啉硫酸盐），而后加入pH值为7.4，浓度0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）液1 ml，离心机3580 g离心20 min后取上清液0.2 ml送往兰州军区总医院放射免疫科检测AngⅡ浓度（pg/ml）。

1.2.4 大鼠心肌组织病理改变及CVF计算心肌石蜡组织切片HE、Masson染色后，光镜下（×400）观察各组HE染色中心肌组织病理改变及纤维化情况并摄片，Masson染色后每张切片选取4个不重叠无血管视野（×400），采用Image-Pro plus 5.0图像扫描软件进行图像分析，计算心肌胶原容积分数（CVF），并以此作为心肌纤维化程度的量化指标。CVF（%）=胶原面积/全视野面积×100%。

1.2.5 p-JNK1/2/3、p-c-Jun含量的测定采用免疫组化SP法（SP试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司）检测大鼠心肌组织中p-JNK1/2/3、P-c-Jun的含量。具体步骤如下：将心肌组织切片置于68℃烤箱中40 min，脱蜡、脱水；蒸馏水冲洗2 min×3次；高压锅抗原修复；蒸馏水冲洗3 min×3次；3%H2O2去离子水37℃孵育20 min；PBS冲洗3 min×3次；山羊血清工作液封闭，37℃孵育15 min，倾去勿洗；滴加1:100兔抗鼠一抗工作液（分别为p-JNK1/2/3多克隆抗体、p-c-Jun，均购自北京博奥森生物技术有限公司）37℃孵育2 h（并用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；PBS冲洗3 min×3次；滴加生物素标记羊抗兔二抗，37℃孵育15～20 min，PBS冲洗3 min×3；然后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS冲洗3 min×3；室温下DAB（购自北京博奥森生物技术有限公司）显色，镜下控制显色时间；自来水充分冲洗；复染；脱水；透明；中性树脂封片；镜检。每张切片中随机各取4个无血管视野（×400），利用Image-Pro plus 5.0图像扫描软件进行图像分析，测定每个视野下阳性物质的平均光密度值，Mean density =累积光密度值（IOD SUM）/面积（area）。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据均以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，并采用Pearson积差进行相关性分析，检验水平（α）为0.05。

2 结果

2.1 模型建立成功结果适应性喂养2周后，参考Zhang等[10]方法采用皮下多点注射大剂量盐酸异丙基肾上腺素（ISO）诱导产生大鼠心房纤维化模型，模型组大鼠按5 mg/kg体质量腹部皮下多点注射ISO（购自上海禾丰制药有限公司），1/d，连续7 d。而对照组给予等量生理盐水多点腹部皮下注射，1/d，连续7 d。各组大鼠于7 d后脱臼处死，通过HE染色确定心肌纤维化程度并与对照组比较，以确定造模成功。行正式实验前均行预实验，证实造模方法可行后方开始正式试验。

2.2 大鼠心房肌组织中AngⅡ的含量结果显示：对照组[（68.51±10.76）pg/L]、DMSO组[（71.47±11.49）pg/L] 中AngⅡ的含量较低，两者差异无统计学意义（P＞0.05）、而干预组[（185.32±54.85）pg/L] 和模型组[（211.25±49.49）pg/L]中AngⅡ的含量较对照组和DMSO组高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠心肌组织纤维化程度及CVF

2.3.1 H-E染色光镜下H-E染色正常心肌组织的细胞核被染成蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞均呈红色。图中可见对照组、DMSO组心肌纤维排列规则而清晰；而模型组肌纤维扭曲肿胀、断裂、排列紊乱、细胞外间隙明显增宽，纤维化程度明显；抑制剂组纤维化程度较模型组明显减轻（图1）。

图1 各组大鼠心肌间质纤维化H-E染色结果（HE×400）

2.3.2 Masson染色和CVFMasson染色时细胞质、心肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈现蓝色，心房肌组织间质胶原成分被染成绿色（图2）。Masson染色后每采用Image-Pro plus 5.0图像扫描软件计算CVF。结果示：对照组[（6.842±1.674）%]、DMSO组[（7.108±1.343）%]和抑制剂组[（7.861±1.867）%]中无明显差别（P＞0.05），而模型组[（29.485±9.966）%]较对照组、DMSO组、抑制剂组升高且差异有统计学意义（P＜0.01）。

图2 各组大鼠心肌间质纤维化Masson染色结果（Masson ×400）

2.4 大鼠心房肌组织中p-JNK1/2/3和p-c-Jun的免疫组化染色及半定量结果如图3、4所示：正常心肌细胞的p-JNK1/2/3和p-c-Jun分布于心肌细胞胞浆中，免疫组化染色阳性呈棕黄色。各组中两者半定量分析结果（表1）：对照组[分别为（0.151±0.016）；（0.163±0.022）]与DMSO[分别为（0.154±0.021）；（0.164±0.024）]组中两者的含量差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组[分别为（0.202±0.025）；（0.254±0.044）]较空白对照组与DMSO组均增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；抑制剂组[分别为（0.160±0.025）；（0.168±0.024）]中两者的含量与空白对照组和DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），而与模型组、QUE组相比含量减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3 各组大鼠心肌组织中p-JNK1/2/3免疫组化染色结果（免疫组化×400）

图4 各组大鼠心肌组织中p-c-Jun免疫组化染色结果（免疫组化 ×400）

表1 各组心房肌组织中p-JNK1/2/3、 p-c-Jun及CVF检测结果（±s）

表1 各组心房肌组织中p-JNK1/2/3、 p-c-Jun及CVF检测结果（±s）

注：A、B、C、D分别代表空白对照组、DMSO组、模型组、抑制剂组。p-JNK1/2/3=磷酸化c-Jun氨基末端激酶1/2/3； p-c-Jun =磷酸化c-Jun蛋白；CVF=胶原容积分数。与A组比较，aP＞0.05；与B组相比较，bP＜0.01；与C组相比较，cP＜0.05

组别 大鼠（只） p-JNK1/2/3 c-Jun CVF A 8 0.151±0.016 0.163±0.022 （6.842±1.674）%B 8 0.154±0.021a 0.164±0.024a （7.108±1.343）% a C 8 0.202±0.025b 0.254±0.044b （29.485±9.966）%b D 8 0.160±0.025bc 0.168±0.024bc （7.861±1.867）% bc

2.5 相关性分析采用Pearson积差相关性分析，p-JNK1/2/3和p-c-Jun的含量与心房纤维化程度呈正相关关系（r=0.881，P＜0.01；r=0.862，P＜0.01）。

3 讨论

AF是临床上最常见的心律失常，具有很高的致残率和致死率，其发病机制的研究一直是医学研究的热点，AF的发生与维持主要与心房的结构重构与电重构有着密切的关系，而心房纤维化是心房结构重构的重要表现形式，因此抑制心房纤维化对于AF的预防和治疗具有重要意义。研究[3,4]表明肾素-血管紧张素系统（RAS）中的主要效应分子--AngⅡ可参与心房纤维化的形成，进一步研究也[5-7]证实AngⅡ导致心肌纤维化的形成主要与激活JNK信号通路有关，而JNK通路作为真核生物中已明确的四条MAPK信号转导通路（细胞外信号调节激酶1/2通路、JNK通路、P38通路、细胞外信号调节激酶5通路）中重要的的通路之一[12]，可参与诱导产生多种生物细胞学效应如：炎症、凋亡、生长及分化等。另有研究指出AF时伴有JNK信号通路的激活，并且该通路参与了AF时心房纤维化的形成[8,9]。既往研究中可以看出AngⅡ可通过激活JNK信号通路，导致心房纤维化，鲍宏刚等[13]研究已表明谷氨酰胺可通过抑制JNK信号通路改善大鼠心房纤维化，但JNK信号通路的直接抑制剂SP600125是否可通过抑制JNK信号通路的激活而起到改善AngⅡ诱导的心房纤维化尚未见相关报道，这将为临床上AF的预防或治疗提供新的思路。由于该实验样本量偏小，检验指标采用的为半定量分析方法，可能数据有一定偏差，但实验结果表明，差异显著。

本实验中大鼠大剂量皮下注射ISO 7 d后发现，模型组心肌组织中AngⅡ含量与对照组和DMSO组相比均增高，p-JNK1/2/3及p-c-Jun的表达增加，并且在模型组出现了明显的心房纤维化。表明注射ISO后，心肌组织中AngⅡ的含量升高并激活了JNK信号通路，使通路中关键蛋白p-JNK1/2/3及p-c-Jun的表达增加，促使大鼠心房肌纤维化的形成。同时说明了溶剂DMSO对JNK信号通路及大鼠心房纤维化无明显影响。

而抑制剂组给予JNK通路抑制SP600125尾静脉注射后心肌组织中p-JNK1/2/3及p-c-Jun的表达较模型组减少，心肌纤维化程度明显减轻。表明SP600125可通过抑制JNK信号通路，有效减轻AngⅡ诱发的大鼠心肌纤维化。

综上所述， 大剂量皮下注射ISO后可激活RAS系统，使心房肌组织中AngⅡ含量升高，后者可通过激活JNK信号转导通路诱发大鼠心房纤维化，而JNK通路抑制SP600125可通过抑制JNK通路的激活起到改善ISO所致大鼠心房纤维化的作用，具有潜在的临床应用价值。但由于该实验样本量偏小，检验指标采用的为半定量分析方法，可能数据有一定偏差。