高效液相色谱法快速检测小麦中交链孢酚单甲醚

徐群英 - 翟羽恒 -

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122)

交链孢霉菌(Alternaria species)在自然界中普遍存在，营寄生或腐生生活，在低温下生长繁殖，具有植物致病性[1]。交链孢霉菌能产生70多种真菌毒素和植物毒素，统称为交链孢毒素。研究[2]表明，人及动物食用被交链孢毒素污染的谷物及饲料会面临急性和慢性毒性、致畸和致癌性、发育和生殖毒性等风险。交链孢酚单甲醚(alternariolmethyl ether，AME)是其中一种主要的、毒性较强的交链孢霉菌代谢产物，属于二苯-α-吡喃酮类化合物，也是谷物及其产品中检出率较高的一种交链孢毒素[3]。

小麦是中国重要粮食作物之一，在一些地区由于收获、加工和贮藏方法不当，小麦交链孢毒素检出率较高，严重影响人畜健康[4-6]。谢莉等[7]对在河南省部分地区销售的95份小麦粉样品进行交链孢毒素检测，发现AME检出率高达98.0%，平均含量为0.0～94.1 μg/kg。目前有关谷物中交链孢毒素降解和消除技术的研究较少[8]，且谷物中交链孢毒素的限量标准和相关检测方法尚未颁布。

目前，定量检测交链孢毒素的方法主要有薄层色谱法(TLC)[9]、气相色谱法(GC)[10]、气质联用法(GC-MS)[11]、液相色谱法(LC)[5, 12-13]、液质联用法(LC-MS)[14-16]和酶联免疫法(ELISA)[17]等。其中，高效液相色谱法(HPLC)是应用最广的检测交链孢毒素的方法，该方法准确性高、分析速度快[18-19]，而检测交链孢霉毒素的液相色谱法主要选用荧光检测器和紫外检测器[4, 12]。试验拟通过考察检测器种类和小麦样品前处理条件对AME的分离和检测效果，以期建立一种检测效果好、准确性强、耗时短、高效的小麦中AME定量分析方法，为国标的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

小麦：市售；

甲醇、乙腈：美国 Fisher Scientific公司；

AME标准品：纯度≥99%，美国Supelco公司；

固相萃取小柱：Bond Elut Plexa，200 mg，6 mL，美国Agilent公司；

色谱柱：ZORBAX SB-aq，150 mm×4.6 mm，粒径5 μm，美国Agilent公司；

氮气、氧气(纯度≥99.8%)：无锡新南化学气体有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备

超纯水仪：Simplicity UV型，电阻≥18.2 MΩ/cm，美国Millipore公司；

高效液相色谱仪：1260系列，带紫外(VWD)和荧光检测器(FLD)，美国 Agilent公司；

真空萃取装置：Vac Elut 12，美国Agilent公司；

氮吹仪：DCY-12G型，青岛海科仪器股份有限公司；

分析天平：BSA124S-CW型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

振荡器：VORTEX 1型，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 AME标准储备液和工作液的配制 将AME标准品溶于乙腈溶液，配制成100 μg/mL的标准储备液，-20 ℃贮藏。临用前，取适量AME标准储备液，加入相应的流动相，配制成1 μg/mL的标准工作液，4 ℃贮藏。

1.2.2 液相色谱检测条件优化

(1)HPLC-FLD液相条件：参考陈月萌等[12]的方法略作修改，进样量10 μL，流速1.0 mL/min。

(2)HPLC-VWD液相条件：进样量10 μL，柱温40 ℃，流动相采用甲醇和1%磷酸水溶液梯度洗脱。0～15 min，55%甲醇，流速0.7 mL /min；15～18 min，55%～65%甲醇，保持3 min，流速1.0 mL/min；然后将甲醇浓度恢复至55%，流速0.7 mL/min，并维持1 min。紫外检测器波长256 nm。

1.2.3 样品提取条件的优化 未污染的小麦经磨粉过0.18 mm孔径筛后，称取250 g小麦粉，加入AME标准工作液，使加标后的样品中AME浓度为400 μg/kg，室温放置过夜后待测。分别称取9份25 g加标小麦粉于150 mL锥形瓶中，加入100 mL溶剂(乙腈/甲醇/水，45/10/45，体积比，pH 3)，分别于20，30，40 ℃下提取30，45，60 min，取上层提取液过滤待用。

1.2.4 样品净化 将Bond Elut Plexa固相萃取小柱依次用甲醇和水活化，取5 mL样品提取液过柱上样，然后用5 mL H2O淋洗，3 kPa真空干燥2 min。用5 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，50 ℃下氮吹仪吹至近干，将固体粉末用流动相复溶。制样时溶液过0.22 μm有机针孔滤膜，滤液供液相色谱仪检测分析。

1.2.5 数据处理 试验结果以“平均值±标准偏差”表示，采用SPSS 16.0软件进行数据分析。单因素方差分析组间差异性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 HPLC条件优化

由图1可知，AME在FLD中出峰时间为7.6 min，与陈月萌等[12]的研究结果相似；在VWD中出峰时间为22.5 min，Pavón等[20]使用VWD检测AME的检出时间为15.6 min，加标回收率为93.6%～101.3%，检出时间和加标回收效果较优于试验结果，可能是由于其使用了粒径更小的色谱柱，使得AME与杂质的分离效果有较大的提高。AME标品在FLD中虽然出峰时间较短但检测信号较低，综合选取VWD及其相应的色谱条件进行AME检测。

2.2 样品提取条件的优化

由表1可知，采用乙腈/甲醇/水(45/10/45，体积比)作为提取溶剂，当提取温度为30 ℃，振荡30 min时，AME回收率最高，达90.60%。

2.3 方法验证

由图2可知，AME检测具有良好的线性，R2为0.999 5，线性范围为0.25～2.00 μg/mL，AME的检出限(S/N=3)为2.52 μg/kg，定量限(S/N=10)为8.40 μg/kg。

图1 AME标准品的检测色谱图

表1 加标小麦样品中AME的提取效果†

† 小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

图2 AME检测标准曲线

由表2可知，AME回收率为80.1%～88.3%，日内精密度和日间精密度分别为2.13%～6.59%，3.57～8.43%。试验方法对加标小麦中AME检测具有良好的回收率和精密度，故此法的重现性好，相对稳定，可用于小麦中AME的检测。

3 结论

当使用VWD检测器，提取温度30 ℃，提取时间30 min时，污染AME的小麦样品经HPLC检测效果最佳。方法的检出限为2.52 μg/kg，定量限为8.40 μg/kg，线性范围为0.25～2.00 μg/mL，AME回收率为80.1%～88.3%，具有良好的日内、日间精密度。后续可通过调节色谱分离柱等方式同时快速检测小麦的主要几种交链孢毒素。

表2 AME检测的准确度和精密度