拟粉红锁掷孢酵母降解展青霉素的机制

孙艺文， 赵利娜， 郑香峰， 林 珍， 李侨飞， 程洋洋， 张红印★

（1. 江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江212013；2. 江苏大学 生命科学研究院，江苏 镇江212013）

联合国粮农组织（FAO）指出，全世界25%的农业作物受真菌毒素的污染，如曲霉属、青霉属、镰刀菌属等产生的真菌毒素[1-2]。 真菌毒素由低相对分子质量的真菌代谢物组成，对人体健康有害[3]。 展青霉素（PAT）又称为棒曲霉素，是苹果及其衍生制品中最常见的真菌毒素，是由曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、拟青霉（Paecilomyces）等真菌代谢产生的一种有毒的代谢产物[4-5]。 近年来，许多国家均报道了展青霉素的污染问题，如意大利、德国、美国、葡萄牙等[6-7]。 通过食用受PAT 污染的食物和饮料严重威胁着人类的健康[8]，PAT 可以氧化损伤人类细胞引起致突变性[9]、免疫毒性[10]、细胞毒性[11]、致畸性[12]以及遗传毒性[13]等。

控制苹果青霉病的发生及苹果中PAT 的污染传统的方法是使用化学合成杀菌剂。 然而，随着化学杀菌剂的持续和大量使用，病原体逐渐产生了抗药性，不仅防治效力降低，而且化学残留物也会对食物造成污染。 因此，人们急需寻求可替代化学杀菌剂的新方法。 近年来，生物防治因其安全、绿色、高效等优点成为一种有发展前景的防治方法。 大量研究表明， 部分酵母菌可以直接抑制PAT 的产生，有的甚至可以降解展青霉素。 例如：卡利毕克毕赤酵母 （Pichia caribbica）[14]、 胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）[15]、 红 冬 孢 酵 母（Rhodosporidium kratochvilovae）[16]、 氧化葡萄糖酸 菌（Gluconobacter oxydans）[17]等拮抗菌均能不同程度地控制和降解PAT。 Zhu 等[18]的 研 究 表 明， 海 洋 红 酵 母（Rhodosporidium paludigenum）可以降低苹果体内展青霉素的含量。 体外实验也表明， 粘红酵母（Rhodotorula glutinis）可以降解展青霉素，使其含量与对照组相比减少82%。

目前，利用生物方法降解真菌毒素的机制主要有：细胞的吸收作用[19]、细胞壁的吸附作用、胞外代谢物的降解作用[20]、胞内酶的降解作用等。然而对于生物降解PAT 的机制研究较少，对于降解途径的研究尚且不够深入，因此，研究拮抗酵母降解PAT 的机制， 有助于推动生物技术降解PAT 的实际应用，研究意义十分重大。 作者所在课题组首次发现拟粉红锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）可以有效控制苹果中PAT 的积累。 因此， 作者对S. pararoseus降解展青霉素的机制进行初步探索，可以为进一步研究其降解PAT 的机理和途径奠定基础，为真菌毒素的生物降解提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 酵母菌 酵母菌S. pararoseus系作者所在实验室分离鉴定并保存的菌种，于NYDA 培养基（酵母浸膏5 g，牛肉膏8 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，无菌水定容至1 L）4 ℃低温保存， 经NYDB 培养基（酵母浸膏5 g，牛肉膏8 g，葡萄糖10 g，无菌水定容至1 L）活化（28 ℃，180 r/min 摇床培养20 h）后，将上述培养混合物在7 500 r/min 下离心10 min，无菌生理盐水洗涤两次，并用无菌生理盐水重新悬浮酵母细胞，血球计数法计数并用无菌生理盐水调至所需浓度。

1.1.2 病原菌 扩展青霉（Penicillium expansum）系作者所在实验室保存的菌种。先接种在PDA 培养基（200 g 土豆沸水煮20 min 后，用纱布过滤，加入20 g 葡萄糖，20 g 琼脂，用蒸馏水定容至1 L），25 ℃培养一周，将分生孢子挑取于无菌水中，用血球计数法计算孢子数量，根据试验要求配制相应浓度。

1.1.3 水果 正常商业成熟度的苹果果实：品种为红富士，选择外观匀称，表面完好无机械损伤的果实， 用0.1%的NaClO 溶液进行浸泡消毒1 min，自来水冲洗若干次，室温下自然风干。

1.1.4 试剂与仪器 PAT 标准品：购于生工生物工程（上海）股份有限公司；环己酰亚胺（Cycloheximide）：购于美国Amresco 公司；酵母浸膏、葡萄糖、冰醋酸、牛肉膏、琼脂：购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈、 甲醇： 色谱纯， 购自TEIDA； 微孔滤膜（0.22 μm）、注射器等：购于华东器化玻公司。

Agilent 1260 液相色谱仪： 购自美国安捷伦公司；恒温摇床：太仓市强乐试验设备厂产品；电子显微镜：江南光学仪器厂产品；高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司产品；血球计数板：购自丹阳市健陵医疗器械公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC-DAD 检测PAT 的条件 参考Cao 等[14]的方法，略有改动。 PAT 检测条件：紫外波长276 nm；色谱柱：反相C18 柱，250 mm×4.6 mm；流动相为乙腈∶水=10∶90；流量：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量20 μL。

1.2.2S. pararoseus对苹果伤口处PAT 的控制作用苹果经1.1.3 预处理后， 在每个苹果果实表面赤道部位用灭菌的打孔器打3 个分布均匀且大小、深度一致的伤口（5 mm×3 mm），用移液器向伤口处分别注入30 μL 溶液。 1）S. pararoseus酵母菌悬液（浓度为1×106~109cells/mL 共4 个梯度）；2） 无菌蒸馏水（对照）。 放置2 h 后，再在每个伤口处注入30 μLP.expansum孢子悬浮液（5×104spores/mL）。 室温下放置1 h 左右，将苹果置于塑料筐中，用保鲜膜密封起来。 将其置于恒温恒湿培养箱（20 ℃，95%RH）中贮藏12 d，用无菌刀沿苹果腐烂伤口外缘1 cm 处将腐烂及周围组织取出，提取净化后测定苹果伤口处的PAT 质量浓度，参考曹婧[21]的方法。每个处理做3个平行，每个平行12 个苹果，整个试验重复2 次。

1.2.3S. pararoseus在体外对PAT 的降解作用 经1.1.1 活化后的酵母细胞，用生理盐水调整其浓度为1×108cells/mL， 在含有20 mL NYDB 培养基的150 mL 锥形瓶中加入1 mLS. pararoseus酵母菌悬液，再加入一定量的PAT 储备液， 使其终质量浓度为5 μg/mL，于28 ℃、180 r/min 摇床培养24 h，每6 小时取一次样，7 500 r/min 离心10 min， 取上清液用微孔滤膜（0.22 μm）过滤后置于-20 ℃冰箱保存，使用HPLC 测定PAT 的质量浓度。每个处理做3 个平行，整个试验重复2 次。

1.2.4S. pararoseus降解PAT 的机制

1）S. pararoseus细胞壁对PAT 的吸附作用：经1.1.1 活化后的酵母细胞，用生理盐水调整其浓度为1×108cells/mL， 取5 mL 酵母悬浮液在100 ℃的沸水中灭活15 min， 在含有20 mL NYDB 培养基的150 mL 锥形瓶中分别加入1 mL 活的酵母细胞、热杀死细胞、以及生理盐水（对照），3 个处理均加入等量的PAT 储备液， 使其终质量浓度为5 μg/mL，于28 ℃、180 r/min 摇床培养18 h， 每3 小时取一次样，每个样品分为离心（7 500 r/min）和非离心2 种处理方法，将培养液经微孔滤膜（0.22 μm）过滤后置于-20 ℃冰箱保存，待HPLC 测定PAT 的质量浓度。 每个处理做3 个平行，整个试验重复2 次。

2）S. pararoseus对PAT 的吸收作用：经1.1.1 活化后的酵母细胞， 用生理盐水调整其浓度为1×108cells/mL，在含有20 mL NYDB 培养基的150 mL 锥形瓶中分别加入1 mLS. pararoseus酵母菌悬液和生理盐水（对照），两个处理均加入等量的PAT 储备液，使其终质量浓度为5 μg/mL，于28 ℃、180 r/min摇床培养18 h，7 500 r/min 离心后用无菌生理盐水洗两次，确保除去培养基中残留的PAT。 使用两种方法测定S. pararoseus对PAT 的吸收作用。 1）参照曹婧[21]的方法，将酵母细胞使用超声波破碎仪1 000 Hz 处理20 min，于分液漏斗中使用乙酸乙酯提取PAT。 2）将离心得到的酵母细胞使用液氮低温研磨，加入相同体积的无菌水和乙酸乙酯，于分液漏斗中分层提取， 将油层于40 ℃高温旋转蒸发近干，用1 mL 乙酸乙酯复溶。 经微孔滤膜（0.22 μm）过滤后置于-20 ℃冰箱保存，待HPLC 测定PAT 的质量浓度。每个处理做3 个平行，整个试验重复2次。

3）S. pararoseus无细胞滤液对PAT 的降解作用：经1.1.1 活化后的酵母细胞，7 500 r/min 离心10 min后，上清液继续离心2 次，将3 次离心后的上清液用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，除去全部酵母细胞，得到含细胞外代谢物的无细胞滤液。 在锥形瓶中加入20 mL 无细胞滤液作为处理组，等量的NYDB 培养基作为对照， 两个处理均加入等量的PAT 储备液，使其终质量浓度为5 μg/mL， 于28 ℃、180 r/min 摇床培养18 h， 每3 小时取一次样，7 500 r/min 离心后将上清液经微孔滤膜（0.22 μm）过滤，置于-20 ℃冰箱保存，待HPLC 测定PAT 的质量浓度。 每个处理做3 个平行，整个试验重复2 次。

4）PAT 刺激下S. pararoseus产生的外代谢物对PAT 的降解作用：经1.1.1 活化后的酵母细胞，用生理盐水调整其浓度为1×108cells/mL，在含有20 mL NYDB 培养基的150 mL 锥形瓶中加入1 mLS. pararoseus酵母菌悬液， 再加入一定量的PAT 储备液，使其终质量浓度为5 μg/mL，于28 ℃、180 r/min 摇床培养6 h， 取出一组经灭菌的微孔滤膜（0.22 μm）过滤，除去酵母细胞得到含酵母细胞外代谢物的无细胞滤液，对照组不处理，继续在28 ℃、180 r/min 摇床培养18 h。 每3 小时取样，7 500 r/min 离心10 min，取上清液用微孔滤膜（0.22 μm）过滤后置于-20 ℃冰箱保存，待HPLC 测定其中PAT 的质量浓度。 每个处理做3 个平行，整个试验重复2 次。

5）环己酰亚胺对S.pararoseus降解PAT 的影响：经1.1.1 活化后的酵母细胞， 用生理盐水调整其浓度为1×108cells/mL，在含有20 mL NYDB 培养基的150 mL 锥形瓶中加入1 mLS. pararoseus酵母菌悬液，分3 组处理：1）在0 h 加入25 μL 质量浓度为1 mg/mL 的环己酰亚胺；2）培养6 h 后，加入25 μL质量浓度为1 mg/mL 的环己酰亚胺；3）不添加环己酰亚胺 （对照）。 3 个处理均加入等量的PAT 储备液，使其终质量浓度为5 μg/mL，于28 ℃、180 r/min摇床培养18 h， 每3 小时取一次样，7 500 r/min 离心后， 将上清液经微孔滤膜 （0.22 μm） 过滤后置于-20 ℃冰箱保存， 待HPLC 测定PAT 的质量浓度。 每个处理做3 个平行，整个试验重复2 次。

6）S. pararoseus胞内酶对PAT 的降解作用：参照Zheng 等[20]的方法，略有改动。活化后的酵母细胞7 500 r/min 离心10 min 后用Tri-HCl （50 mmol/L，pH 7.0）清洗两次，取湿质量5 g 的酵母细胞经液氮快速研磨，溶于10 mL Tri-HCl 中，冰上放置30 min，促进胞内酶的溶解，4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，收集上清液。 未加酵母细胞的提取液作为对照，加入终质量浓度为5 μg/mL 的PAT。 于28 ℃、180 r/min摇床培养3 h，取样后用微孔滤膜（0.22 μm）过滤后置于-20 ℃冰箱保存，待HPLC 测定其中PAT 的质量浓度。 每个处理做3 个平行，整个试验重复2 次。1.2.5 数据分析 试验结果用SPSS16.0/PC 统计软件进行统计分析。 当需要比较的试验组总数超过3个时，采用ANOVA 程序对结果进行Duncan's 多重比较差异分析（P＜0.05），当需要分析的组数为2 时，采用独立样本来实行平均数分析。

2 结果与分析

2.1 S. pararoseus 对苹果伤口处PAT 的控制作用

由图1 可以看出， 使用S. pararoseus能显著降低苹果伤口处PAT 的积累量。 当酵母浓度为1×108cells/mL 时，PAT 的积累量最低仅为6.08 μg/mL，而空白对照高达17.34 μg/mL。 经过酵母处理后果实伤口处PAT 积累量与对照相比至少降低了1.2 倍。

图1 S. pararoseus 对苹果伤口处展青霉素积累的影响Fig. 1 Efficacy of S. pararoseus on controlling of patulin in wounds of apple fruits

2.2 S. pararoseus 在体外对PAT 的降解作用

如图2 所示，PAT 可以被S. pararoseus降解，并且随着时间的延长，PAT 的质量浓度不断降低，培养18 h 后PAT 的质量浓度已无法检测到， 然而对照组PAT 的质量浓度在整个实验中几乎保持不变。

图2 S. pararoseus 对PAT 的降解作用Fig.2 Efficacy of S.pararoseus on the biodegradation of PAT

2.3 S. pararoseus 降解PAT 的机制

2.3.1S.pararoseus细胞壁对PAT 的吸附作用 图3显示，无论是活细胞还是热杀死细胞，取离心后上清液和直接取培养液进行测定，两者之间PAT 的质量浓度相差不大， 这就表明S. pararoseusY16 细胞壁没有吸附PAT 的作用。 由此可知，S. pararoseusY16 降解PAT 的过程需要活的酵母细胞，并不是由于细胞壁对PAT 的吸附作用。

图3 S.pararoseus 活细胞和热杀死细胞对PAT 的降解作用Fig. 3 Efficacy of viable cells and heat-killed cells of S.pararoseus on the biodegradation of PAT

2.3.2S.pararoseus对PAT 的吸收作用S.pararoseus与PAT 共同培养18 h 后，使用无菌水洗涤除去残留的PAT 和培养介质，无论是使用超声波破碎仪还是液氮研磨破碎细胞，使用HPLC 检测其中的PAT 质量浓度。结果显示，破碎的细胞中均不含有PAT。因此，S. pararoseus对PAT 的降解并不是由于细胞对PAT 的吸收作用。

2.3.3S. pararoseus细胞外代谢物对PAT 的降解作用 如图4 所示，在培养的18 h 内，体系中PAT 的变化趋势与对照组几乎一致， 含有S. pararoseus细胞外代谢物的无细胞滤液并没有降低PAT 的质量浓度，由此可知，S. pararoseus在正常生长代谢过程中产生的细胞外代谢物不能够降解PAT。

2.3.4 PAT 刺激下S. pararoseus产生的外代谢物对PAT 的降解作用 如图5 所示，当PAT 与S.pararoseus共同培养6 h 后滤除酵母细胞， 无细胞滤液中PAT的质量浓度几乎没有变化，而未过滤酵母细胞的处理，共同培养15 h 后就几乎检测不到PAT 的存在。

图4 S. pararoseus 细胞外代谢物对PAT 的作用Fig.4 Efficacy of cell-free culture filtrates of S.pararoseus on the biodegradation of PAT

图5 PAT 刺激下S.pararoseus 外代谢物对PAT 的降解作用Fig. 5 Efficacy of S. pararoseus was filtered after 6 h onthe biodegradation of PAT

实验结果表明，PAT 刺激下S. pararoseus并没有产生降解PAT 的细胞外代谢物。

2.3.5 环己酰亚胺对PAT 降解的影响 未加入环己酰亚胺（S. pararoseus单独处理）的处理组，在培养15 h 后显著降低了PAT 的质量浓度，然而0 h 添加PAT 的同时添加环己酰亚胺的处理组，培养18 h后PAT 的质量浓度由6.1 μg/mL 降为4.2 μg/mL，说明添加环己酰亚胺确实影响了酵母细胞对PAT的降解作用。 当添加PAT 共培养6 h 后再添加环己酰亚胺时，PAT 的质量浓度随着时间增长而降低，和不添加环己酰亚胺相比，S. pararoseus对PAT 的整体降解速率显著低于未添加环己酰亚胺组，但是环己酰亚胺并没有完全阻止酵母细胞对PAT 的降解作用，培养18 h 后未添加环己酰亚胺组已完全检测不到PAT， 而添加PAT 共培养6 h 后再加入环己酰亚胺处理组中仍含有PAT 2.6 μg/mL。

图6 不同时间添加环己酰亚胺对S. pararoseus 降解PAT的影响Fig. 6 Efficacy of S. pararoseus added cycloheximide on different time on the biodegradation of PAT

2.3.6S. pararoseus胞内酶对PAT 的降解作用 经液氮研磨提取的胞内酶与PAT 共同培养3 h 后，经HPLC 测定PAT 的质量浓度发现，胞内酶已将PAT完全降解，而对照组的PAT 质量浓度并无变化。 结果表明， 高浓度的S. pararoseus胞内酶可以迅速降解PAT。

3 讨 论

微生物具有物种的多样性，因而生物降解PAT的机理也是具有多样性的。 为了探究S. pararoseus降解PAT 的作用机制，作者验证了其降解机制。 结果证实， 无论是S. pararoseusY16 活细胞还是热杀死细胞，离心前后PAT 的质量浓度几乎相同，说明PAT 并没有被酵母细胞的细胞壁吸附。 由于灭活的细胞是没有任何代谢能力的，只能利用细胞壁将毒素吸附，而细胞吸附的毒素往往可以通过反复清洗细胞的方法使部分毒素从细胞表面脱离。 由此可知，S. pararoseusY16 对于PAT 的降解作用并不是因为细胞壁的吸附作用， 而是必须有活细胞的参与。 这与Dong 等[22]的研究结果一致，研究表明PAT的降解需要活的Kodameae ohmeri酵母细胞。 而Yue 等[23]则发现灭活的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以降解苹果汁中75%的PAT。然而Zhu等[18]的研究则发现，灭活的R. paludigenum细胞可以吸附51%的PAT。

当S. pararoseus与PAT 共同培养20 h 后，无论是经超声波破碎仪还是液氮研磨破碎细胞，经HPLC 测定后均未发现PAT， 说明S. pararoseus降解PAT 也不是通过细胞的吸收作用。PAT 既没有被细胞壁吸附，也没有被细胞吸收进细胞内，而又检测不到PAT 的存在， 由此可以推测PAT 被酵母的代谢产物降解了。 Coelho 等[24]的研究也证实了PAT的降解机理之一是酶作用的过程。

作者研究了S. pararoseus细胞外代谢物对PAT的降解作用。由图4、图5 可知，S. pararoseus正常代谢过程中产生的细胞外代谢物和PAT 刺激S.pararoseus代谢产生的细胞外代谢物均不能降解PAT。 而Zheng 等[20]的研究结果表明，P. caribbica在PAT 的刺激下可以产生大量的胞内和胞外代谢物，可以显著降低PAT 的质量浓度。

环己酰亚胺是一种蛋白酶抑制剂，可以阻断蛋白质的合成，影响多种酶的作用途径。 因此，作者也研究了环己酰亚胺对酵母菌降解PAT 的影响。结果表明，在0 h 添加PAT 同时添加环己酰亚胺严重影响了酵母菌对PAT 的降解作用。而添加PAT 6 h 后再添加环己酰亚胺，S. pararoseus仍然可以降解PAT， 但其降解速度显著低于未添加环己酰亚胺的处理组。 可以推断，S. pararoseus可以产生降解PAT的酶，而环己酰亚胺切断了相关酶的产生，因此添加环己酰亚胺后，S. pararoseus降解PAT 的效率显著降低。 当添加PAT 6 h 后再添加环己酰亚胺，因为此时S. pararoseus已经产生了降解PAT 的酶，此时添加环己酰亚胺， 并不能完全抑制S. pararoseus对PAT 的降解作用。由此可知，S. pararoseus对PAT的降解作用确实是酶作用的过程。 Dong 等[25]的研究也得出了相似的结论，环己酰亚胺可以抑制S.cerevisiae对真菌毒素玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEN）的降解作用。 而S. pararoseus胞内酶对PAT 的降解作用的结果表明，胞内酶可以快速降解PAT，共同培养3 h 后，HPLC 已检测不到其中的PAT。 说明S.pararoseus降解PAT 的作用机制不是由于细胞壁对PAT 的吸附作用，也不是由于酵母细胞的吸收作用，而是活的酵母细胞在正常代谢过程中产生的胞内酶对PAT 的降解作用。

4 结 语

展青霉素是一种世界范围内的真菌毒素污染物，在许多水果及其制品中均有发现[26]。近年来由于生物降解安全、高效、无污染等优点，真菌毒素的生物降解已经成为研究热点。 对于S. pararoseus降解PAT 作用机制的研究，可以为拮抗菌降解真菌毒素的研究提供一定的理论基础。 然而若想完全了解拮抗菌降解真菌毒素的机制， 还需要进行更多的研究，如确定具有降解作用的胞内酶并对其进行分离纯化及鉴定； 利用蛋白质组学或转录组学等技术，对降解过程中发挥重要作用的蛋白质或基因进行筛选和鉴定，从而为真菌毒素的生物降解提供全新的视角和途径。