重组融合蛋白MBP-PAI 的表达、纯化及酶活测定

黄昕畑， 张白曦， 陈海琴， 张 灏， 陈 卫

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

反10，顺12-共轭亚油酸（t10，c12-CLA）是一种具有两个共轭双键的十八碳二烯酸，是共轭亚油酸最重要的活性单体之一[1]。t10，c12-CLA 具有多种生理功能，如减少机体脂肪积累、预防动脉粥样硬化、调节免疫、抗肿瘤等[2]。 该脂肪酸也因此成为目前研究的热点，在食品工业和药品、保健品行业拥有巨大的发展前景。

来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（PAI）是惟一一种晶体结构已知的亚油酸异构酶[3]。 由于痤疮丙酸杆菌是一种致病菌，因此将PAI 在其他宿主微生物中表达迫在眉睫，在这之中研究最多的就是PAI 在大肠杆菌的表达。 研究表明， 在大肠杆菌中PAI 多以不可溶的包涵体形式存在[4-5]；将PAI 与组氨 酸 标 签 （His-tag）、 谷 胱 甘 肽 巯 基 转 移 酶（Glutathione S-transferase，GST）和小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-likemodifier，SUMO）融合表达也不能有效减少其包涵体的形成，PAI 活性蛋白的表达量依然很低[6-8]，这给PAI 未来的应用造成了困难。 因此，作者通过基因工程手段，将能够提高蛋白质可溶性的标签——麦芽糖结合蛋白 （Maltosebinding protein， MBP）与PAI 在低温诱导表达载体pColdV 中融合表达，通过优化诱导培养条件，提高了PAI 在大肠杆菌中的可溶性表达水平，并将重组融合蛋白纯化得到了具有活性的可溶性蛋白质。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

菌株E.coliBL21、E.coliBL21 （DE3）（pET24apai）：均保藏于江南大学生物技术中心；质粒pColdV：购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶： 购自New England Biolabs （北京）有限公司；氨苄青霉素（Amp）、溶菌酶（lysozyme）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：购自上海生工生物工程技术有限公司；MBP 亲和层析柱MBPTrap HP：由GE Healthcare 提供；质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒：均购自天根生化科技（北京）有限公司；其余试剂：为国产分析纯产品。 全基因合成由金斯瑞生物科技有限公司（南京）提供，本实验所需的引物合成及测序工作均由华大基因完成。

蛋白质纯化所需缓冲液配方如下： 结合缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.4），洗脱缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 麦芽糖，pH 7.4）。

1.3 培养基

LB 培养基：胰蛋白胨体积分数1%，酵母浸出粉体积分数0.5%， 氯化钠体积分数1%，pH 7.0，高压灭菌20 min。 所需抗生素为100 μg/mL 氨苄青霉素。 固体培养基是在上述培养基中加入2 g/L 的琼脂。

1.4 重组融合蛋白质表达载体的构建

以来源于E.coli编码MBP 的基因malE(Genbank：AHM36606.1)为模板，将malE基因合成并连接至质粒pUC57 上，全基因合成由南京金斯瑞公司完成。 分别用KpnI/HindIII限制性内切酶双酶切pUC57-MBP，切下malE基因并切胶回收，与同样酶切的载体pColdV 在16 ℃连接反应过夜，构建pCold-MBP 重组质粒。

以PAI 的基因pai(Genbank：AX062088)为模板，设计PCR 扩增引物。 上游引物P1：5’-CCCAAGCTT ATGTCCATCTCGAAGGATTCACG-3’，下游引物P2：5’-GCTCTAGATTACACGAAG AACCGCGTCAC-3’，其中划线部分分别为限制性酶切酶识别位点HindIII、XbaI。引物均由华大基因合成。以作者所在实验室前期构建的含有pai基因的质粒pET24a-pai为模板，PCR 扩增基因pai，PCR 程序为：95 ℃2 min，95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃24 s， 72 ℃5 min， 30个循环。HindIII/XbaI双酶切纯化回收后的PCR 产物， 用并与同样酶切的pColdV-MBP 载体在16 ℃连接反应过夜，转化E.coliBL21 感受态细胞，涂布于含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB 平板上， 挑选菌落，质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆并送至华大基因测序，构建融合蛋白质表达质粒pCold-Mpai。

1.5 重组融合蛋白质诱导表达条件的优化

挑取重组菌株单个菌落， 接种于5 mL 含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB 培养基中，37 ℃振荡培养过夜， 再以2%的比例转接于50 mL 含100 μg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中。

1.5.1 诱导温度对MBP-PAI 蛋白表达的影响 将重组菌株培养3~4 h 至OD600值为0.4~0.5 时， 取5支试管，每管分装扩大培养液10 mL，分别将试管放在冰水中冷却培养液到10、15、20、28、37 ℃并放置30 min， 加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L， 分别于10、15、20、28、37 ℃培养24 h。 以4 ℃、10 000 r/min离心收集菌体，并将其重悬于结合缓冲液中，超声破碎细菌并于4 ℃、6 000 r/min 离心10 min， 收集上清液即为全细胞蛋白质，加入适量1×蛋白质上样缓冲液，吹打混匀后沸水浴10 min，利用SDS-PAGE电泳分析蛋白质表达情况并确定最佳诱导温度。

1.5.2 诱导剂IPTG 浓度对MBP-PAI 蛋白表达的影响 将重组菌株在摇瓶中培养至OD600为0.4~0.5时，取5 支试管，每管分装扩大培养液10 mL，分别按0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L 的终浓度加入诱导剂IPTG，15 ℃下培养24 h，离心、破碎菌体后收集上清液作为全细胞蛋白质， 利用SDS-PAGE 分析、比较蛋白质表达量的多少以确定最佳诱导浓度。

1.5.3 诱导时间对MBP-PAI 蛋白表达的影响 加入IPTG 至终浓度为0.1 mmol/L， 在15 ℃下诱导表达，在培养3、6、12、18、24 h 时分别取10 mL 菌液，离心收集菌体并超声破碎，再次离心收集上清液并利用SDS-PAGE 研究培养时间对重组蛋白质表达的影响。

1.6 最佳诱导条件下MBP-PAI 蛋白的可溶性表达量比较

将本研究构建的重组菌株在上述最佳诱导条件下诱导表达，取全细胞蛋白质于4 ℃、12 000 r/min再次离心20 min，取上清液即为可溶性蛋白质。 将全细胞蛋白质与可溶性蛋白质进行SDS-PAGE 分析， 并与本实验室构建的含有pai基因的E.coliBL21（DE3）（pET24a-pai）进行可溶性表达比较，以研究融合标签MBP 对PAI 可溶性表达的影响。

1.7 MBP-PAI 重组蛋白的纯化

将MBP 亲和层析柱用结合缓冲液预先平衡，待层析柱完全平衡后， 将MBP-PAI 可溶性蛋白以0.5 mL/min 的速度缓慢上样至层析柱，静置0.5 h 使蛋白质与柱填料充分结合； 再用结合缓冲液以1 mL/min 的速度进行洗脱，并同时用紫外检测器（280 nm）和记录仪观察洗脱情况，待洗脱液中无蛋白质后， 换含有10 mmol/L 麦芽糖的洗脱缓冲液洗脱MBP-PAI 融合蛋白，洗脱速度为1 mL/min。 收集各阶段样品进行SDS-PAGE 电泳检测。

1.8 酶活测定

酶活测定方法参考宋宇航酶活测定方法[9]。 将底物LA 与适量粗酶液或纯化后的蛋白质反应1 h，经氯仿-甲醇提脂，并用重氮甲烷甲酯化，进行气相色谱测定。

以LA 转化生成t10，c12 -CLA 的转化率代表PAI 粗酶液的酶活， 转化率%=[CLA]/([LA]+[CLA])×100%。 以气相色谱结果计算纯蛋白质的比酶活。

2 结果与分析

2.1 融合表达载体pCold-MPAI 的构建及鉴定

对转化后的阳性克隆子进行鉴定， 用KpnI/XbaI双酶切的结果见图1。 双酶切后分别产生大小约为4 398 bp 和2 418 bp 的产物，与预期相符。 将重组质粒送至测序， 序列与Genbank 比对一致，无移位与突变。

图1 重组质粒pCold-Mpai 的图谱（a）及双酶切鉴定电泳图谱（b）Fig. 1 Map of pCold-Mpai (a) and restriction map of pCold-Mpai(b)

2.2 诱导温度对重组蛋白质表达的影响

诱导温度是重组菌体的生长和蛋白质表达的一种重要影响因素。 为了探究最佳的诱导温度，将重组蛋白MBP-PAI（90 000）分别在10、15、20、28、37 ℃下进行表达，SDS-PAGE 电泳结果见图2。在诱导温度为10、15、20 ℃时， 灰度扫描分析重组蛋白MBP-PAI 表达量基本相同，15 ℃表达量略高于其他两组；随着诱导温度继续升高至28 ℃时，表达量明显降低；诱导温度继续升高为37 ℃时，MBP-PAI表达情况与空载体对照相比无差异，灰度扫描分析也证明了MBP-PAI 无表达。 因此，重组菌株的最佳诱导温度为15 ℃。pColdV 是一个冷休克表达载体，它利用了大肠杆菌的低温表达基因cspA作为启动子调控蛋白质的表达，因此，较高的温度不利于该启动子发挥其作用，这一结果也与Qing 的研究一致[10]。

图2 不同诱导温度对重组蛋白MBP-PAI 表达的影响Fig. 2 Effect of different induction temperature on the expression of MBP-PAI

2.3 诱导剂IPTG 浓度对MBP-PAI 蛋白表达的影响

为了探究诱导剂对于重组蛋白质表达的影响，设置了5 个不同的IPTG 浓度梯度， 分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L。 将重组菌株在15 ℃下诱导24 h 后，取胞内蛋白质进行SDS-PAGE 分析，结果见图3。 与空白对照相比，在这5 个不同的IPTG 浓度下重组蛋白质均有表达。 当IPTG 浓度由0.01 mmol/L上升至0.1 mmol/L 时，重组蛋白质的表达量明显增大，在浓度为0.1 mmol/L 时，蛋白质表达量达到最高；但随着IPTG 浓度继续增大，表达量明显降低。这证明较高的IPTG 浓度会影响菌株正常生长，从而影响蛋白质的表达量。 为了减少IPTG 对细菌毒性作用，确定IPTG 最佳浓度为0.1 mmol/L。

2.4 诱导时间对MBP-PAI 蛋白表达的影响

为了使重组蛋白质最大量表达，我们在上述试验的基础上， 进一步对诱导表达时间进行了优化，见图4。 在3~12 h 范围内， 随着诱导时间的延长，MBP-PAI 重组蛋白质的表达量逐渐增大； 在12 h之后，目的蛋白质表达量趋于稳定。 为了提高效率，确定诱导表达的最佳诱导时间为12 h。

2.5 最佳诱导条件下重组蛋白质的可溶性表达情况

图3 不同IPTG 浓度对重组蛋白MBP-PAI 表达的影响Fig. 3 Effect of IPTG on the expression of MBP-PAI

图4 不同诱导时间对重组蛋白MBP-PAI 表达的影响Fig.4 Effect of induction time on the expression of MBP-PAI

在上述确定的最佳诱导条件（诱导温度15 ℃、IPTG 添加量0.1 mmol/L 、诱导时间12 h）下，比较融合蛋白MBP-PAI 与非融合蛋白PAI 的可溶性表达情况， 以确定融合标签MBP 对PAI 可溶性表达的影响。SDS-PAGE 结果见图5，泳道1、2 分别为本实验构建的重组菌株的可溶性蛋白质和全细胞蛋白质，箭头所示为融合蛋白MBP-PAI 的条带；泳道3、4 分别为将pai 基因单独表达的重组菌株E.coliBL21（DE3）（pET24a-pai）的可溶性蛋白质和全细胞蛋白质，箭头所示为PAI 的条带（50 000）。分析结果显示， 融合蛋白MBP-PAI 在该诱导条件下大量表达，表达量约是PAI 的12 倍。 同时，在电泳图中可以清楚的看到， 重组蛋白MBP-PAI 大部分以可溶蛋白质的形式存在， 而未与MBP 融合的PAI 可溶性表达量非常低，大部分以包涵体形式存在，二者的可溶性蛋白质的比例约为18∶1 （MBP-PAI∶PAI）。证明与MBP 融合表达后， 无论是PAI 的表达量还是可溶性表达量都大幅提高。

图5 最佳诱导条件下重组蛋白质的可溶性表达情况Fig. 5 Soluble expression of recombinant protein underoptimal induction condition

2.6 MBP-PAI 重组蛋白的纯化

经MBP 标签亲和纯化后的结果见图6。 泳道1为最佳诱导表达条件下重组菌株的可溶性蛋白质；泳道2 为上样后的流出液；泳道3 为经结合缓冲液洗脱的杂蛋白质， 可见有极少量MBP-PAI 被洗脱下来，但对后续的洗脱影响不大；泳道4 为洗脱缓冲液洗脱下的蛋白质， 可见MBP-PAI 融合蛋白纯度较高。

图6 重组菌株E.coli BL21(pCold-Mpai)的表达产物纯化及SDS-PAGE 分析Fig.6 Purification and SDS-PAGE analysis of the expression products of recombinant strain E.coli BL21 (pCold-Mpai)

2.7 MBP-PAI 重组蛋白的酶活测定

分别对重组菌株E.coliBL21(pCold-Mpai)和对照菌株E.coliBL21（DE3）（pET24a-pai）的粗酶液进行酶活测定并计算其转化率，结果见图7。重组菌株MBP-PAI 粗酶液转化率为66.1%，约是对照菌株的1.5 倍。 这证明融合蛋白质能够转化LA 形成t10、c12-CLA，MBP 能够通过提高PAI 的可溶性而提高酶的活性。 对纯化后的MBP-PAI 蛋白进行酶活性测定， 根据气相色谱测定结果计算得出比酶活为1.58 U/mg。 以上结果是MBP 融合标签在蛋白质表达中发挥优势作用的又一例证。

图7 MBP-PAI 粗酶液与PAI 粗酶液催化LA 生成CLA的转化率Fig.7 Conversion rate of LA to CLA catalyzed by recombinant MBP-PAI and PAI

3 结 语

目前，大部分重组蛋白质使用的表达载体是大肠杆菌细胞，这是因为大肠杆菌表达的外源蛋白质量大， 通常达到细胞内蛋白质总量的5%~20%，甚至达到50%以上。 但是，由于大肠杆菌细胞缺少折叠机制，当外源蛋白质大量表达时，这些蛋白质通常以包涵体形式存在，这些不可溶的蛋白质甚至可以占到胞内蛋白质的50%以上，这大大影响了蛋白质在大肠杆菌中的表达和应用。 PAI 酶在大肠杆菌中的表达就出现上述情况[3-6，8]。

为了解决这一问题， 作者利用MBP 与PAI 融合表达，并结合低温诱导型启动子cspA 的特性，将PAI 在大肠杆菌中融合表达。 MBP 是一种来自大肠杆菌周质的高可溶性蛋白质，常被当作促溶标签与目的蛋白质融合表达以提高可溶性。 研究表明，当麦芽糖结合在融合环境中使用时，MBP 通过显示分子伴侣的内在性质来促进目标蛋白质的溶解，同时，MBP 还能够促进靶蛋白的适当折叠， 有利于靶蛋白的构象和活性中心的恢复[11]。 cspA 是一种低温诱导型启动子，启动强度较弱，在较低的温度下可以使目的蛋白质的表达较为缓慢，有利于蛋白质的折叠及细胞对蛋白质的加工和转运，从而形成更多具有活性的可溶性蛋白质[12]。 本研究构建的重组菌株E.coliBL21 (pCold-Mpai) 结合了上述两者的优势，将PAI 在大肠杆菌中高效可溶性表达，其最佳诱导表达条件为诱导温度15 ℃、IPTG 添加量0.1 mmol/L 、诱导时间12 h。在该诱导条件下，与未融合MBP 的PAI 相比，MBP-PAI 的表达量是后者的12倍，可溶性表达量是后者的18 倍。 同时，与未融合的PAI 相比， 重组蛋白MBP-PAI 的粗酶液酶活是前者的1.5 倍，纯化后的融合蛋白MBP-PAI 比酶活为1.58 U/mg，是目前报道的较高水平。 本研究结果不仅提供了减少PAI 包涵体的解决方法， 还为PAI在工业中生产t10，c12-CLA 奠定了基础。