人工全髋关节翻修术患者血清金属离子浓度与假体周围组织病理学改变的相关性分析

宫丽华 陈曦 顾建明 邵宏翊 周一新 丁宜

人工关节置换术已经成为挽救关节功能的最终有效方法。然而，随着手术量的增加，术后并发症引起的关注也与日俱增。其中主要的并发症为假体松动，假体与骨之间会形成厚薄不一、宽度不等的结缔组织包裹物即假体周围膜形成[1-2]。即使植入物固定良好，其周围也可形成膜。股骨柄周围可以形成非常薄(0.1～0.3 mm)的膜；随着假体存活率的增加，髋臼假体周围的膜可逐渐增厚至1.0 cm[3]。假体松动可由假体周围感染所致，形成感染性松动，也可以是无菌性松动。无菌性松动通常由聚乙烯颗粒、骨水泥、陶瓷和金属颗粒等导致的假体周围骨溶解所致。轻到中度假体周围骨溶解源于假体周围膜的细胞及酶的活性升高或骨与假体交界处微环境中各类细胞因子的相互作用[4-5]。颗粒引起的松动源于人工关节植入人体后引发一些物理、化学及生物学反应导致的离子释放效应。金属人工关节释放的金属离子主要来源于关节界面机械磨擦产生的细小金属微粒，离子入血造成血金属离子浓度升高。同时，关节液也会出现金属离子浓度升高，引起植入物周围金属离子增加，加剧假体周围组织内金属颗粒的沉积[6]。目前，金属颗粒及金属离子在假体周围组织中的作用并不明确。本研究探讨人工全髋关节翻修术患者血清金属离子浓度与假体周围组织中金属颗粒数量、坏死程度、组织细胞增生及血管周淋巴细胞聚集的相关性，以期为临床抗细胞毒及超敏反应研究奠定基础。

资料与方法

一、资料

纳入北京积水潭医院矫形骨科2015年1月至2018年9月接受人工髋关节翻修术患者18例。其中男、女各9例，左髋8例，右髋10例，平均年龄59(43～73)岁。其中6例假体界面为金属对金属(metal-on-metal，MOM)，金属成分均为钴铬钼合金；其余12例假体界面为钴铬钼合金对聚乙烯(metal-on-polyethylene，MOP)。MOP组包括骨水泥臼杯2例、钛合金臼杯10例，钴铬钼合金柄4例、钛合金柄8例。排除骨肿瘤切除后人工髋关节置换术患者。所有患者体内无其他含铬、钴、钛内植物。

二、方法

1.术前血清金属离子浓度检测：患者术前空腹状态下采静脉血，分离血清后入冰箱冷冻保存。送检至北京大学医学部毒理学系，测定血清铬、钴、钛离子浓度。应用动态反应池(dynamic reaction cell，DRC)电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)技术检测[7]。使用仪器为Elan DRC Ⅱ ICP-MS仪器(珀金埃尔默仪器有限公司，美国)。

2.假体周围组织标本取材：标本以4%中性甲醛固定，部分质硬标本以98%甲酸和4%中性甲醛(1∶1)脱钙液进行脱钙处理，石蜡包埋，3 μm切片，HE染色。对于假体周围组织的取材数量未见相关规定。本研究按照软组织取材规范每间隔1 cm取材1块，厚度2～3 mm。针对不同体积组织分别取材2～5块。取材时尽可能顾及标本的不同部位。

3．假体周围坏死的组织学评判：Davies等对表面组织坏死分型如下：1型为表面滑膜上皮完整；2型为表面滑膜上皮局部缺失，未见纤维素沉积；3型为表面被覆上皮缺失伴纤维素性沉积；4型为滑膜结构广泛破坏伴坏死，未见正常结构存留[8]。本研究依据这一分型方法将假体周围组织坏死分为4级。4级：4型坏死>75%；3级：25%≤4型坏死≤75%；2级：4型坏死<25%或3型坏死；1级：2型坏死。

4.假体周围组织细胞增生的半定量评判：将假体周围组织内组织细胞增生分为4级。0级：缺失；1级：偶见；2级：簇状；3级：弥漫成片[9]。

5.假体周围组织中金属颗粒数量的评判：采用肝细胞内铁离子评估方法，将颗粒数量分为5级。0级：400倍镜下颗粒缺失或几乎缺失；1级：250倍镜下颗粒几乎缺失,400倍镜下容易见到颗粒；2级：100倍镜下散在分解颗粒；3级：25倍镜下散在分解颗粒；4级：10倍镜下大量颗粒或裸眼可见颗粒[10]。

6．假体周围组织中血管周淋巴细胞聚集的评判：无菌性淋巴细胞为主型血管炎相关病变(aseptic lymphocytic vasculitis associated lesion，ALVAL)提示金属致敏性淋巴细胞主导的Ⅳ型超敏反应。采用Grammatopoulos等[11]建立的Oxford-ALVAL评分系统对血管周淋巴细胞聚集进行半定量计数分级。0级：无血管周淋巴细胞浸润；1级：极少量血管周淋巴细胞浸润，血管周淋巴细胞套厚度<5个细胞；2级：少量血管周淋巴细胞聚集，血管周淋巴细胞套厚度为5～10个细胞；3级：大量血管周淋巴细胞聚集，血管周淋巴细胞套厚度>10个细胞。

7.统计学处理：Spearman相关分析适用于等级变量和有序变量之间，数据<30对，总体样本是否呈正态分布均可，应用范围较广泛。既往研究结果表明，相较于Pearson相关系数检验，Spearman秩相关系数检验的灵敏度更高。本研究使用SPSS 20.0软件，导入数据，选择Spearman秩相关分析，使用单尾检验，P<0.05为差异有统计学意义。Kendall等级相关系数是常用于描述2个测量量序数关联的统计量，可精确计算小样本的相关关系，样本总体分布可以不满足正态分布。为进一步验证，本研究采用Kendall'stau-b作为检验统计量，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、血清金属离子浓度

经术前检测，本研究组患者血清金属离子浓度为铬(6.53±11.95)μg/L、钴(4.94±5.27)μg/L、钛(119.41±40.51)μg/L。

二、假体周围组织大体特征

无菌性假体周围组织呈灰褐色囊壁样结构，腔内面光滑，可见绒毛状突起，周围组织呈增生状，衬覆假体面的组织因附着金属颗粒而呈黑色(图1)。假体磨损严重病例可见金属颗粒将膜样组织全部覆盖呈黑色(图2)。

图1 假体周围见灰褐色囊壁样结构，衬覆假体面的组织因附着金属颗粒呈黑色

图2 假体周围组织因全部被金属磨损颗粒覆盖呈黑色

三、假体周围组织镜下特征

金属假体周围组织滑膜可显示不同程度的病变，完整的滑膜衬覆可见上皮细胞完好，滑膜呈乳头状结构，上皮缺失程度不同，从部分缺失至完全缺失均可见到。滑膜上皮部分缺失可有一层纤维素附着，伴有上皮下组织机化；滑膜上皮完全缺失则未见上皮被覆，伴广泛纤维组织增生、玻璃样变性，并呈现无细胞区。坏死可出现于滑膜表面或深部组织(图3)，往往与纤维素性渗出混合存在，也可出现大片坏死不伴有细胞及组织结构。坏死结果为1级和2级各1例，3级3例，4级13例。组织细胞增生可呈灶状，可成片分布于滑膜上皮下，细胞胞浆丰富、呈泡沫样，胞浆内可见吞噬细小的金属颗粒(图4)。组织细胞增生结果为0级1例，1级2例，2级7例，3级7例，4级1例。淋巴细胞可散在分布于组织细胞间，也可表现为血管周围少量或多量淋巴细胞聚集，少数病例出现弥漫淋巴细胞聚集伴有淋巴滤泡形成，浆细胞可与淋巴细胞并存(图5，6)。血管周淋巴细胞聚集结果为0级1例，1级11例，2级5例，3级1例。

四、假体周围组织金属颗粒数量

金属磨损颗粒沉积于受累组织内使其呈灰黑样。镜下，金属颗粒呈圆形、杆状或不规则小黑色颗粒。金属颗粒位于组织细胞胞质内和成纤维细胞间，在细胞内显示为细小黑色颗粒，在细胞间显示为团状黑色颗粒(图7)。金属沉积严重的病例可呈现纤维组织间弥漫黑色颗粒(图8)。在偏振光镜下，金属颗粒未见折光性。假体周围组织金属颗粒数量结果为0级1例，1级2例，2级5例，3级4例，4级6例。

五、相关性分析

1.血清金属离子浓度与病理学结果的相关性：血清铬、钴、钛离子浓度与假体周围组织金属颗粒数量相关，Spearman相关系数检验P值分别为0.038、0.042、0.004；与假体周围坏死、组织细胞增生以及血管周淋巴细胞聚集无相关性。见表1。

2.假体周围组织金属颗粒数量与病理学结果相关性分析：假体周围组织金属颗粒数量与组织细胞增生和血管周淋巴细胞聚集的Kendall'stau-b等级相关系数检验P值分别为0.004和0.002。假体周围组织金属颗粒数量与组织细胞增生和血管周淋巴细胞聚集相关，与坏死不存在相关性。见表2。

图3 滑膜表面纤维素性渗出伴坏死(HE×100) 图4 组织细胞胞浆内可见吞噬细小的金属颗粒(HE×200) 图5 血管周围散在少量淋巴细胞(HE×100) 图6 滑膜表面纤维素性渗出伴坏死(HE×100) 图7 淋巴细胞聚集伴有初级淋巴滤泡形成(HE×100) 图8 纤维组织间弥漫黑色金属颗粒(HE×100)

表1 血清金属离子浓度与假体周围组织病理学改变的相关性

表2 假体周围组织金属颗粒数量与病理学改变的相关性

讨 论

金属假体具有高度抗磨损特点，可以减少人工关节置换术后假体磨损，并且使用寿命较长，近年来为骨科所广泛使用。然而，随着人工关节应用的增多，其金属离子钴和铬的潜在毒性也受到越来越多的关注。一些研究结果已经显示，金属人工关节置换术后血清钴和铬离子浓度升高[12]。但是，目前对于这种血清金属离子浓度的升高与假体周围组织反应的关系并不清楚。

金属假体周围组织对金属的反应可以是实性、囊性或混合性的，其命名也多种多样，如囊肿、粘液囊、炎性包块、金属反应、金属高敏感、金属碎屑的不良反应、局部组织不良反应以及假瘤等。这些名称分别覆盖了假体周围组织对金属不同方面的反应，但都不十分准确。囊肿或粘液囊提示液体的存在，反应却与实性包块不同；金属高敏感提示超敏反应但却不包括金属碎屑的毒性效应。Pandit等[13]引入假瘤一词，将其定义为由于无菌性炎症、液体积聚或其他原因导致的局部组织增大形成类肿瘤样结构，包括了周围组织对假体反应的所有方面。假瘤样组织的形成一方面可能由于大量磨损颗粒的形成导致局部细胞毒性效应。被巨噬细胞吞噬的金属颗粒不能被溶酶体消化，在酸性环境下，这些颗粒连同前列腺素E2(prostin E2，PGE2)等炎性介质可以被释放，导致周围组织坏死，同时这些颗粒还会被其他巨噬细胞吞噬，使该过程反复发生，引起局部组织坏死较重或骨溶解[14]。因此，在炎性浸润并不明显的组织内坏死可以很显著，这一过程提示细胞毒机制的存在[15]。另一方面，假瘤的形成也可能由于存在金属的超敏反应。临床上，金属碎屑在体液和组织内的沉积可以导致局部和系统性不良反应，也称为“金属碎屑的不良反应(adverse reaction to metal debris，ARMD)”或“局部组织不良反应(adverse local tissue reactions，ALTR)”[16]，ALTR是MOM髋关节置换术失败的主要原因[17]。对于临床表现的不良反应，Willert等[18]引入了ALVAL概念，Compbell等[19]在2010年建立了假瘤组织的Compbell-ALVAL评分系统，对ALTR组织形态进行描述。此评分系统囊括了滑膜的衬覆和完整性以及组织机化、巨噬细胞和炎细胞的浸润，在组织机化的评估中包括了局灶坏死。关于血清金属离子水平升高与ALVAL的相关性仍存在争议。有文献报道血清金属离子水平升高与假体周围ALTRs的发生有很强的相关性[20]。但是，顾建明等[21]通过对17例人工髋关节翻修术患者血清钴和铬离子浓度与ALVAL相关性研究发现，二者无相关性。Plummer等[22]对80例MOM假体翻修术患者进行研究，也认为血清金属离子浓度和病理学ALVAL评分没有相关性。Compbell-ALVAL评分系统是对假体周围组织进行综合评价，其中每个独立指标与金属磨损的相关性并不明确，而且该系统没有针对可能与金属致敏性密切相关的淋巴细胞的单独评分。2013年，Grammatopoulos等[11]进一步建立了Oxford评分系统，其对血管周围淋巴细胞聚集的半定量计数为Oxford-ALVAL评分。目前，血液循环中金属离子对患者全身系统的影响并不明确，从本研究结果看来，血液循环中金属离子浓度与局部组织的反应如坏死、组织细胞及淋巴细胞的分布并无关系。

除血清中的金属离子浓度外，本研究还对假体周围组织内沉积的金属颗粒进行了观察与定量分析。形态上，金属颗粒均为细小的黑色颗粒，直径可达0.1 mm，但对其中的钛、钴、铬、钼等难以区分。金属颗粒呈现细小颗粒状分布或小团块状聚集，严重时呈大片黑色弥漫分布，组织细胞内可见吞噬的细小颗粒，但由金属颗粒导致的多核巨细胞形成并不显著。通过对血清金属离子浓度与组织内金属颗粒半定量评分进行相关性分析发现，组织内金属颗粒与血清铬、钴和钛离子浓度均有相关性。但是，在假体周围以外的部位并未发现金属沉积，因此推测血清金属离子浓度的升高可能不是导致局部组织金属颗粒沉积的主要因素。随着血清金属离子浓度的升高，关节液金属离子浓度也会增高，而且由于关节液与金属假体紧密相邻，假体磨损可能会导致关节液金属离子浓度升高先于血清，因此局部组织内金属颗粒的沉积也可能来源于关节液。本研究未对关节液金属离子浓度进行测定，有待于将来进一步分析以验证这一推测。另外，假体周围组织对金属假体的直接磨损可能导致磨损颗粒沉积于假体周围组织内，成为造成局部组织内金属颗粒沉积的第3个因素。

在假体周围组织中组织细胞反应很常见，当增生显著时可能与组织细胞源性肿瘤相混淆。组织细胞主要表现为吞噬各类磨损颗粒，胞浆呈泡沫样，内含细小金属磨损颗粒。当磨损颗粒较大时，假体周围组织表现为多核异物巨细胞吞噬或包绕异物颗粒，有时组织细胞成为假瘤组织的主要组成成分。局部沉积的金属颗粒可能对假体周围组织中的组织细胞具有诱导及趋化作用，使组织细胞聚集并吞噬金属颗粒，与此一致的是本研究中发现金属颗粒与组织细胞分布有密切相关性。Grammatopoulos等[11]发现坏死及组织细胞增生与假体磨损呈中等程度相关，认为组织细胞反应为对于磨损颗粒的非特异性反应。认为坏死是金属离子释放的结果。假体周围离子浓度升高及金属颗粒尤其是钴在局部组织的沉积，更易于产生巨噬细胞的毒性反应，这些磨损颗粒对于滑膜上皮的毒性作用可引起上皮缺失及溃疡形成。尽管坏死可能是细胞毒机制的形态学体现，但本研究通过对表面组织坏死的分型及分级半定量评估，发现其与血清金属离子浓度及金属颗粒数量均无相关性。因此，细胞毒机制的产生可能与金属离子浓度及组织内颗粒数量并无关系。金属颗粒可能作为诱导因子诱导细胞毒效应的产生及放大，但这一过程的启动和增强与诱导因子的量无关。本研究通过应用Oxford-ALVAL评分系统发现，假体周围组织内沉积的金属颗粒与淋巴细胞分布具有密切相关性，这一结果进一步说明局部组织的金属颗粒可引起局部组织内的淋巴细胞反应，即Ⅳ型超敏反应的产生。

本研究的结果将为临床抗细胞毒及超敏反应研究奠定基础。本研究具有一定的局限性：一是样本数量较少；二是组织的评估结果取决于取材部位及数量，存在主观性和片面性。后续可通过加大样本数量加以弥补。同时我们提倡假体周围组织全部取材，以克服取材的高选择性造成的不足。