间歇性θ爆发式磁刺激对高血压大鼠胼胝体髓鞘及局部炎症反应的影响☆

蔡颖 邱宝山 廖梦诗 刘晓露 林晶 蓝琳芳 徐光青 范玉华○☆

脑白质病变是脑小血管病主要的病理类型之一，临床表现包括认知功能障碍、步态异常和自主神经功能紊乱等[1]。目前脑白质病变的发病机制尚未阐明，髓鞘脱失、神经炎症和胶质细胞活化是常见的脑白质病变病理改变[2-3]。经颅磁刺激是一种成熟的非侵入性治疗手段，除了常用于评估和调节神经元兴奋性外，有研究显示经颅磁刺激可改善颅内脱髓鞘动物模型的髓鞘脱失，还可调控多种动物模型颅内星形胶质细胞增生和小胶质细胞的活化[4]。间歇性 θ爆发式磁刺激（intermittent theta burst stimulation，iTBS）是一种改良的重复经颅磁刺激序列，与传统的序列相比有更强的可控性、一致性和刺激强度，刺激效果可维持更长时间[5]。iTBS用于改善脑白质病变的髓鞘脱失及机制尚缺乏研究。本研究拟采用易卒中型肾血管性高血压大鼠 （stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP）模型模拟人类高血压动脉硬化性脑白质病变，探究iTBS治疗对大鼠胼胝体区域髓鞘脱失、星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 26只4周龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购于广东省实验动物中心），体重约70～90 g，饲养于中山大学北校区实验动物中心（SPF级环境）。实验过程全部遵循科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。利用随机数表法随机选取20只大鼠接受双肾双夹术制备RHRSP模型[6]（n=20），其余6只大鼠接受假手术（假手术假刺激组，n=6）。 采用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后取仰卧位固定大鼠，作腹部正中切口，仔细分离双侧肾动脉，于肾动脉根部用特制银夹钳夹双侧肾动脉，后逐层缝合皮肤。假手术大鼠未钳夹双侧肾动脉，余操作同前。术后22周，7只RHRSP于不同时间死亡，具体死因不明确，剩余13只RHRSP接受间接尾动脉法检测血压：12只 RHRSP收缩压大于170 mmHg[7-8]且无明显卒中症状，纳入进行下一步实验，利用随机数表法随机平均分为两组：高血压iTBS组（n=6）和高血压假刺激组（n=6）；1只RHRSP收缩压不足170 mmHg,被排除。

1.2 iTBS治疗 双肾双夹术后22周行iTBS治疗，刺激仪使用武汉依瑞德CCY-IA磁刺激仪，8字线圈。线圈平放在被固定的大鼠颅骨上。高血压iTBS组刺激序列采用20%的最大输出强度，共600个脉冲，持续3 min 20 s，每天1次，连续14 d。高血压假刺激组和假手术假刺激组接受相同序列刺激，但线圈与大鼠颅骨垂直。

1.3 脑组织取材 治疗结束后，对所有大鼠行灌注取脑：用4%多聚甲醛经心脏灌注后取出大脑，予4%多聚甲醛后固定过夜，20%、30%蔗糖溶液梯度脱水，用OCT包埋后，取前囟约+1.8 mm到-1.8 mm区域行冠状面冰冻切片（10 μm），保存于-80℃冰箱中。

1.4 苏木素伊红染色 取冰冻切片水化后放入苏木素染液中染色3 min，1%盐酸乙醇分化，后用伊红染液染色40 s。流动水漂洗后乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察胼胝体区域脑小动脉形态。

1.5 免疫荧光染色 取冰冻切片行免疫荧光检测：山羊血清室温封闭1 h，一抗为小鼠抗大鼠碱性髓鞘蛋白 （myelin basic protein,MBP，1：500，abcam）抗体、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP，1：800，abcam）抗体和兔抗大鼠钙离子结合配体分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，IBa-1，1：300，Wako）抗体，4℃冰箱静置过夜。PBS漂洗后滴加山羊抗兔或山羊抗小鼠免疫荧光二抗（1：500，CST），荧光显微镜下观察。

1.6 统计学方法 采用Graphpad Prism 8进行统计学分析，计量数据以表示。每只大鼠分别选取3张非连续切片进行观察，每张切片选取5个非连续视野。MBP阳性染色面积比例定义为MBP阳性染色面积占该视野总面积的百分比，采用ImageJ计算。GFAP阳性或IBa-1阳性细胞计数时，GFAP阳性或IBa-1阳性且DAPI阳性的细胞纳入分析。IBa-1阳性细胞胞体面积计算时，IBa-1阳性且DAPI阳性的细胞胞体（不包含分枝部分）纳入分析。数据采用单因素方差分析，组间差异有统计学意义时用LSD-t检验行两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 苏木素伊红染色 高血压假刺激组和高血压iTBS组观察到胼胝体区域内出现小动脉硬化表现包括内膜增厚、管腔狭窄，假手术假刺激组未发现小动脉硬化表现（图1）。

2.2 MBP免疫荧光染色 MBP用以标记胼胝体区域的髓鞘。MBP免疫荧光染色显示：与假手术假刺激组相比，高血压假刺激组出现明显的MBP阳性面积比例减少，差异具有统计学差异（P＜0.01），提示胼胝体区域髓鞘脱失。而与高血压假刺激组相比，高血压iTBS组胼胝体区域MBP阳性面积比例明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图2），说明iTBS治疗显著改善髓鞘脱失。

2.3 GFAP免疫荧光染色 GFAP用以标记胼胝体中的星形胶质细胞。GFAP免疫荧光染色显示：假手术假刺激组胼胝体区域GFAP标记的星形胶质细胞数量较少。高血压假刺激组胼胝体区域可见星形胶质细胞数量明显增加，差异具有统计学差异（P＜0.01），提示星形胶质细胞增生。而与高血压假刺激组相比，高血压iTBS组胼胝体区域星形胶质细胞数量明显减少，差异具有统计学意义 （P＜0.01），提示星形胶质细胞增生程度较高血压假刺激组轻（图 3）。

2.4 IBa-1免疫荧光染色 IBa-1用以标记胼胝体小胶质细胞。IBa-1免疫荧光染色显示：与假手术假刺激组相比，高血压假刺激组胼胝体区域可见IBa-1（+）细胞数量明显增加，细胞胞体增大，差异有统计学差异（P＜0.01），细胞突起变粗，分枝减少，符合小胶质细胞活化的表现。与高血压假刺激组相比，高血压iTBS组胼胝体区域IBa-1（+）细胞数量明显减少，胞体缩小，差异具有统计学意义（P＜0.01），细胞形态呈分枝状，突起细长，分枝较多，提示小胶质细胞活化程度减轻（图4）。

3 讨论

图2 各组大鼠胼胝体区域MBP表达情况 A:各组大鼠胼胝体区域MBP免疫荧光染色图（400×），CC：胼胝体，Bar=50 μm。B:各组大鼠胼胝体区域MBP阳性面积比例统计，**P＜0.01

图3 各组大鼠胼胝体区域GFAP（+）星形胶质细胞数量改变 A:各组大鼠胼胝体区域GFAP免疫荧光染色图（400×），Bar=50 μm；B:各组大鼠胼胝体区域GFAP（+）星形胶质细胞数量统计图，**P＜0.01

图4 各组大鼠胼胝体区域IBa-1小胶质细胞活化程度改变 A:各组大鼠胼胝体区域IBa-1免疫荧光染色图（400×），Bar=50 μm；B:各组大鼠胼胝体区域IBa-1小胶质细胞数量统计图，**P＜0.01；C:各组大鼠胼胝体区域IBa-1小胶质细胞胞体面积统计图，**P＜0.01

本研究发现高血压所致脑白质病变大鼠胼胝体区域存在小动脉管腔结构改变、髓鞘脱失、星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，而iTBS治疗可改善髓鞘脱失，抑制星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化。

高血压是脑白质病变的重要危险因素[9]。本课题组前期研究显示，双肾双夹术后20周可利用MRI观察到脑白质疏松[10]，术后24周病理学检查可见高血压大鼠胼胝体、尾状核、内囊和外囊等区域白质疏松，神经纤维排列紊乱，纤维疏松、断裂，可见弥漫的空泡形成[11]，提示术后20～24周的RHRSP模型可出现明显的脑白质损害，故我们认为，RHRSP模型可能是适合的脑白质病变动物模型。

中枢神经系统的髓鞘由少突胶质细胞形成，它包裹着神经元轴突，通过其电绝缘特性将动作电位限制在无髓鞘突触的郎飞结，以实现动作电位沿神经纤维的快速传导。此外，髓鞘为神经元轴突的完整和存活提供了关键的营养支持[12]，髓鞘的缺失和破坏将对大脑的功能产生影响。髓鞘脱失是脑白质病变的典型表现。脑白质病变大鼠模型的胼胝体区域可观察到明显的髓鞘脱失[13]，对晚期脑白质病变患者的大脑尸检显示其脑白质区域也出现明显的髓鞘脱失和空泡形成[14]。本研究通过病理学检测发现，高血压iTBS组MBP表达量较高血压假刺激组明显升高，说明iTBS可减缓长期高血压导致的胼胝体区域髓鞘脱失。CULLEN等[15]研究发现，iTBS治疗可促进成年健康小鼠胼胝体的髓鞘生成，与本研究结果相似。既往研究表明，经颅磁刺激对髓鞘的调节作用可能是间接的。经颅磁刺激可调节神经元的放电活动，少突胶质细胞和少突胶质前体细胞可对神经元的活动作出响应，从而实现对髓鞘的调节[16-17]。

慢性高血压刺激星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，介导慢性炎症和神经损伤，是脑白质病变的重要病理过程[2,18]，对星形胶质细胞和小胶质细胞的调节是治疗脑白质病变的重要潜在靶点。本研究发现，iTBS治疗可明显抑制高血压大鼠脑白质病变中星型胶质细胞增生和小胶质细胞活化。然而，既往研究中，经颅磁刺激对胶质细胞的作用存在争议。KIM等[19]在脊髓损伤大鼠模型的研究认为重复经颅磁刺激治疗缓解了星形胶质细胞的增生和小胶质细胞的激活。与此相反，RAUŠ等[20]发现交变磁场可增加沙鼠缺血模型中活化胶质细胞的数量。而另外3项研究并未发现经颅磁刺激对星形胶质细胞和小胶质细胞数量的影响[21-23]。造成结果差异的原因可能有：① 星形胶质细胞和小胶质细胞与多种细胞间存在相互作用，其行为受多种细胞因子调控，在不同的动物模型中，这些细胞和细胞因子可能在磁场刺激下发生不同改变，故星形胶质细胞和小胶质细胞的变化趋势不尽相同。② 以上的实验在刺激频率、刺激时间和刺激强度方面有所不同，刺激效果存在差异。这些因素导致了rTMS治疗效果的多样性和复杂性，故在对某种特定范式对特定疾病的应用方面，都需要进行谨慎的研究和观察。本研究应用iTBS治疗，发现其可抑制慢性高血压所致的星形胶质细胞增生和小胶质细胞的活化，为iTBS的安全性提供了病理学证据。

本研究初步探讨了iTBS治疗对高血压所致脑白质病变大鼠胼胝体区域髓鞘脱失、星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化的改善作用，为iTBS在脑小血管病治疗的临床应用提供一定的理论依据。本研究存在不足之处，未能针对iTBS对于髓鞘脱失、星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化的具体调节机制进行深入探讨。