杨梅黄酮对铅染毒雄性小鼠生精功能及激素水平的影响

陈宗耀，李乐乐，王振滔，许世林，李瑶，王艳春，范红艳△

杨梅黄酮（myricetin）是杨梅树皮、树叶、果实中的主要活性成分，也可来源于藤茶、锦葵科植物及红提、山楂、葡萄等水果。杨梅黄酮具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗肿瘤等生物活性［1］，主要通过影响细胞增殖、凋亡、癌基因蛋白表达而发挥抗肿瘤作用［2］，也可抑制血小板聚集及血小板标记蛋白CD41的上调及PI3K/Akt信号通路的活化而发挥抗血栓作用［3］。另有研究显示，其可通过抗氧化、抗凋亡作用发挥对急性心肌缺血的保护作用［4］，通过降低血糖、改善糖原代谢、提高胰岛素敏感性、类胰岛素作用、抗炎、抗氧化应激等发挥防治糖尿病作用［5］。但是，有关杨梅黄酮对生殖系统的研究少见。本研究用醋酸铅建立雄性小鼠的生精障碍模型，旨在观察杨梅黄酮对铅染毒雄性小鼠生精功能及激素水平的影响，并探讨其作用机制，为生精障碍的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级昆明雄性小鼠60只，体质量23～27 g，月龄1.5个月，购于吉林大学生命科学院，动物许可证号SCXK（吉）2014-0013。

1.2 主要仪器与试剂 电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），显微镜（日本奥林巴斯光学工业株式会社），离心机（德国艾本德股份公司，型号5430R），722可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；Model 680型酶标仪（美国Biorad公司）。杨梅黄酮（西安万滋生物科技有限公司，批号WZ16025，质量分数98%），醋酸铅（上海化学试剂厂的分析纯试剂），甲睾酮（天津力生制药股份有限公司，批号1602003）；小鼠睾酮（T）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、山梨醇脱氢酶（SDH）酶联免疫试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和造模 昆明种小鼠60只随机均分为6组，即对照组、染铅组、杨梅黄酮低、中、高剂量组（100、200、400 mg/kg）、甲睾酮组（10 mg/kg，即阳性对照组），每组10只。除对照组，各组均腹腔注射醋酸铅20 mg/kg，连续7 d，对照组腹腔注射等体积的生理盐水，自造模2 d开始杨梅黄酮组、甲睾酮组灌胃给药，连续42 d，1次/d，杨梅黄酮不溶于水，故选用0.25%羧甲基纤维素钠溶液为助溶剂，对照组和染铅组灌胃相同体积的羧甲基纤维素钠溶液。末次给药后禁食不禁水24 h，小鼠称体质量后10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血约0.8 mL，静置30 min以上，956×g离心15 min，取血清备用。

1.3.2 睾丸指数测定 断髓处死后，快速取双侧睾丸和附睾，剥除脂肪组织及筋膜，迅速称睾丸质量并计算睾丸指数（mg/g）=睾丸质量（mg）/小鼠体质量（g）。

1.3.3 精子密度检测 取双侧附睾迅速放于2 mL 37.0℃的生理盐水培养皿中，用探针将附睾充分剥离开后置于37.0℃恒温箱中孵育15 min，使精子游出。4层擦镜纸过滤，得稀释后的精液。取上述稀释后的精液100µL，加3%NaCl 100µL混匀后，取10µL滴在血细胞计数板上盖玻片的边缘，精液自行渗入，于400倍光学显微镜下按红细胞计数法计算精子密度（1 mL的精子数=N×5×稀释倍数×104；N为5个中方格精子数之和，本实验中稀释倍数为2）。对于压线精子的计数原则是数头不数尾，数上不数下，数左不数右。每份样品平行计数2次，求平均数。

1.3.4 精子畸变实验 取精液1滴于载玻片上涂片。空气中干燥后，用甲醇固定5 min以上。1%伊红染色1 h，水轻轻冲掉多余染剂，干燥。置于镜下统计畸形精子数，畸形精子定义为双头、双尾、无钩、无定形、尾折叠等。为了减少误差，对同一个样品应进行3次精子计数，求其平均数。

1.3.5 血清中T、LH、FSH含量的测定 取血清，严格按试剂盒说明用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清中T、LH、FSH含量。

1.3.6 睾丸组织中SDH活性、MDA含量的测定 取10%睾丸组织匀浆上清液，严格按试剂盒说明书操作，采用ELISA测定睾丸组织中SDH活性；采用硫代巴比妥酸法检测睾丸组织中MDA含量。取10%睾丸组织匀浆上清液稀释至1%，检测睾丸组织蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。

1.3.7 睾丸HE染色 将睾丸于4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，切片用于HE染色观察睾丸组织结构变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，2组间比较采用Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组睾丸指数、精子密度及精子畸形率的比较 与对照组比较，染铅组小鼠睾丸指数及精子密度降低、精子畸形率增高（P＜0.05）；与染铅组比较，杨梅黄酮各剂量组、甲睾酮组睾丸指数及精子密度均升高、精子畸形率下降（P＜0.05），杨梅黄酮各剂量组、甲睾酮组之间睾丸指数、精子密度及精子畸形率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 各组血清中T、LH、FSH含量比较 与对照组比较，染铅组血清中T含量减低，而LH和FSH升高（P＜0.05）；与染铅组比较，杨梅黄酮各剂量组及甲睾酮组血清中T含量升高、LH、FSH含量均降低（P＜0.05），杨梅黄酮各剂量组、甲睾酮组之间T、LH、FSH含量差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 各组睾丸组织中SDH活性、MDA含量的比较 与对照组比较，染铅组小鼠睾丸组织中MDA含量增高、SDH活性降低（P＜0.05）；与染铅组比较，杨梅黄酮各剂量组及甲睾酮组睾丸组织中MDA含量降低、SDH活性增高（P＜0.05），杨梅黄酮各剂量组、甲睾酮组之间MDA含量、SDH活性差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 小鼠睾丸组织的病理变化 HE染色睾丸组织切片观察，对照组睾丸生精小管排列紧密，生精细胞层次和数量多，生精上皮较厚，生精小管腔可见精子形成；染铅组与对照组比较，睾丸组织多数生精小管直径明显变细，间距较宽，生精上皮变薄，生精细胞层次和数量均减少，生精小管腔见少量精子形成；杨梅黄酮低剂量组与染铅组形态接近，杨梅黄酮中剂量组与染铅组比较，生精上皮稍增厚，生精细胞层次和数量见增多。杨梅黄酮高剂量组及甲睾酮组较染铅组明显改善，生精上皮厚，生精细胞层次和数量多，生精小管腔内见较多精子生成，见图1。

3 讨论

随着现代工业的迅猛发展，重金属铅广泛并持久存在于人们生活与工作的环境中，铅的环境和职业暴露已受到全球的广泛关注［6］。铅是联合国粮农组织（FAO/WHO）公布的对人体毒性最强的重金属（铅、镉、汞）之一。国内学者对铅致我国男性生殖健康影响的Meta分析显示：铅可引起阳痿率和早泄率的升高，精子数量减少，活动力下降、畸形率升高［7］。因此，从优生优育角度考虑，铅对男（雄）性生殖毒性的研究一直较受重视。利用天然的排铅产品拮抗铅的生殖毒性已成为研究的重点，比如苦杏仁苷［8］，苦参总黄酮［9］，橄榄叶［10］等。Dobrakowski等［11-12］研究发现，铅的生殖毒性与氧化应激损伤关系密切。

Tab.1 Comparison of testis index,sperm density and sperm deformity rate between six groups表1 6组睾丸指数、精子密度、精子畸形率比较 ［n=10，M（P25，P75）］

Tab.2 Comparison of serum levels of T,LH and FSH between six groups表2 6组血清中T、LH、FSH含量比较［n=10，M（P25，P75）］

Fig.1 Pathological changes of testicular tissues in six groups of mice(HE staining,×400)图1 6组小鼠睾丸组织病变情况（HE染色，×400）

Tab.3 Comparison of MDA content and SDH activity of testis tissue between six groups表36组睾丸组织中MDA含量、SDH活性比较

本研究采用腹腔注射醋酸铅20 mg/kg连续7 d，构建雄性小鼠生精障碍模型。甲睾酮是人工合成的甾体激素，其临床主要用于治疗男性性功能减退等，本实验选择甲睾酮作为阳性对照药。精子质量为反应雄性生精功能的一个重要指标。本研究中染铅组睾丸病理显示，小鼠睾丸组织明显损伤，小鼠睾丸指数、精子密度明显下降，精子畸形率增高，表明铅染毒雄性小鼠生精障碍模型建立成功。本研究结果显示，给予杨梅黄酮及甲睾酮处理后，小鼠睾丸指数、精子密度升高，精子畸形率降低，杨梅黄酮中、高剂量组睾丸组织病理与染铅组比较，生精上皮增厚，生精细胞层次和数量明显增多，表明杨梅黄酮各组及甲睾酮组精子质量明显提高，提示杨梅黄酮具有改善生精功能的作用。

精子的发生受到下丘脑-垂体-睾丸轴的内分泌调节，并与睾丸中多种酶的活性密切相关。下丘脑分泌促性腺激素释放素（GnRH），GnRH可以刺激垂体分泌FSH和LH，LH刺激睾丸间质细胞分泌T。研究表明，精子质量指标与其生殖激素水平密切相关［13］。本研究显示，染铅组小鼠血清中T含量下降，LH、FSH含量增高，而杨梅黄酮组及甲睾酮组血清中T含量增高，LH、FSH含量下降，考虑可能原因为，铅损伤睾丸组织，而减少T合成，最终导致精子质量下降。同时T水平不足，会反馈到下丘脑-垂体-睾丸轴，使得上游激素含量升高。而杨梅黄酮可以改善睾丸功能，使得T合成增加，精子质量提高，T合成增加会负反馈调节下丘脑-垂体-睾丸轴上游激素，使得LH和FSH含量下降，这与Huhtaniemi等［14］研究一致，提示FSH与LH有协同作用。综上，杨梅黄酮作用于睾丸组织，促进睾酮分泌，从而改善睾丸的生精功能，而对于下丘脑-垂体-睾丸轴上游激素的具体影响机制还有待进一步研究。

SDH是糖有氧氧化阶段三羧酸循环过程中的限速酶，参与精子能量代谢，可作为睾丸成熟、精子功能成熟和形态完善的标志酶［15］。相关研究表明，SDH负责为精子细胞提供能量，将山梨糖醇转化为果糖，SDH的活性与生精细胞的功能有关［16］。因此，采用精子特异性酶SDH作为检测指标，结果可靠。本研究结果显示，染铅组小鼠睾丸组织中SDH活性较对照组下降，而杨梅黄酮组小鼠睾丸组织中SDH活性较染铅组增高，考虑可能原因为杨梅黄酮可使睾丸组织中SDH活性增高，从而提高精子质量，表明杨梅黄酮作用于睾丸组织，提高睾丸及精子活性，从而改善睾丸的生精功能。

MDA是内源性脂质过氧化的分解产物，脏器组织中MDA含量可表示脂质过氧化作用的强弱，MDA含量越高，脂质过氧化作用越强。本研究结果显示，染铅组较对照组MDA水平升高，脂质过氧化作用增强，精子质量下降；杨梅黄酮组与染铅组小鼠比较，MDA含量明显下降，考虑可能原因为杨梅黄酮通过抗氧化作用，对活性氧引起的生殖细胞氧化损伤有抑制作用，而杨梅黄酮作用于睾丸组织，通过抗氧化作用、减轻醋酸铅所致睾丸组织氧化应激损伤，从而改善睾丸的生精功能。

综上所述，杨梅黄酮对铅染毒小鼠的生精功能具有一定保护作用，机制可能为杨梅黄酮通过抗氧化作用、减轻醋酸铅所致睾丸组织氧化应激损伤，促进睾酮的分泌，提高了睾丸及精子活性，从而改善睾丸的生精功能。杨梅黄酮来源较广，具有一定的开发价值，但有关杨梅黄酮保护生精功能的具体细胞信号转导机制还需进一步探讨。